都柿果酒在酿制过程中总酚和花色苷含量和抗氧化活性

张晓松，孙艳梅，胡振生，李冬梅，冯志彪*

（1.东北农业大学理学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省带岭林业科学研究所，黑龙江 带岭 153106）

分布于东北地区的野生越桔有3种，即红豆越桔（Vaccinium vitisidaea L.），笃斯越桔（Vaccinium uliginasum L.）和朝鲜越桔（Vaccinium koreanum）。笃斯越桔又名笃斯（都柿）、甸果、地果、龙果、黑豆树、蛤塘果等，它的果实为浆果，成熟后呈蓝紫色，果实酸甜可食。耿星河等测定发现笃斯越桔的阴干果实中含有多种营养物质，有粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、碳水化合物、多种矿质元素等，还含有17种氨基酸和多种维生素[1]。研究报道了蓝莓果中还含有鞣花酸、鞣花单宁、叶酸、花色素苷等多酚类化合物[2]。都柿果实具有多种疾病防治及保健功能，如：良好的防脑神经老化、强心、抗癌等保健功能、由于笃斯越桔为人瞩目的营养价值，它已经被加工成丰富的果汁、果酒产品出现在市场。笃斯越桔中含有丰富的花色苷类成分，在果汁、果酒加工过程中不添加任何人工色素，果汁、果酒也具有亮丽的红色。

许多研究表明，因为食品中含有多酚、维生素等具有清除自由基能力的物质，所以，每天摄取一定量的水果和蔬菜可以减少患心血管疾病的几率[3-4]。作为一种多酚类天然色素，花色苷是迄今为止所发现的最有效的天然水溶性自由基清除剂，其淬灭自由基的能力是VC的20倍，VE的50倍。花色苷稳定性差，特别是在中性或碱性pH和加热的情况下很容易降解。试验进行了笃斯越桔果酒在加工过程中多酚及花色苷含量和抗氧化活性的变化研究，研究都柿中花色苷和总酚含量与清除自由基能力的相关性，旨在证明都柿果酒中的总酚和花色苷是重要的起抗氧化作用的物质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸矢车菊色素（Cyanidin Chloride）（购自Sigma）；果胶酶（购自上海蓝季科技发展有限公司）；啤酒酵母（购自安琪酵母股份有限公司）；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器

7500UV/可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；离心机（北京医用离心机厂）；电子天平（上海天平仪器厂）；超纯水器（UPW-20NE,北京厉元电子仪器公司）；恒温培养箱（哈尔滨市东联技术开发有限公司）；果汁加工机（PHILIPS）。

1.3 方法

1.3.1 笃斯越桔果酒加工

1.3.1.1 工艺流程

笃斯越桔果酒加工工艺流程见图1。

图1 笃斯越桔果酒加工工艺Fig.1 Technological procedures of juice processing of Vaccinium uliginasum L.

1.3.1.2 工艺说明

①原汁制备：250 g笃斯越桔果用果汁加工机破碎，加2倍蒸馏水，添加0.5 mL H2SO3，沸水浴加热灭菌1 h，作为原汁备用。②酵母的添加：0.3 g葡萄酒酵母用30 mL五倍稀释原汁溶解，25℃，保温20 h，使酵母活化。在H2SO3添加8 h后，接种全部活化酵母。③果胶酶用量：加0.1 g。④调整成分：加糖15 g。测定原汁酸度为10.57 g酒石酸·L-1。酸度较高，加碳酸钙2.045 g，调酸度至7.5 g酒石酸·L-1。⑤ 控温发酵：在恒温培养箱中发酵，温度25℃，发酵7 d。⑥后酵：发酵醪比重降至1.020时，即将酒放出，滤去皮渣，送往密闭的三角瓶，室温放置，后酵30 d。比重降到0.993时，发酵认为完全停止。⑦新酒：后酵液减压过滤，沸水浴加热灭菌1 h，罐装，得新酒。⑧酸度测定方法：用标准氢氧化钠溶液滴定测定。⑨糖含量测定方法：按照国标还原糖的测定方法定量分析。⑩比重测定方法：用比重计测定。

1.3.2 总酚测定方法（Folin-Ciocalteu试剂法）

Folin-Ciocalteu显色剂的配制参见文献[5]。

标准曲线的制作：分别配制8.33、16.7、25.0、33.3、41.7、50 μg·mL-1焦没食子酸溶液。取如上述浓度焦没食子酸溶液各1.2 mL，加1.0 mL稀释2倍的Folin-Ciocalteu显色剂，加 5 mL，1 mol·L-1碳酸钠溶液避光放置1 h，测760 nm下的吸光度。绘制标准曲线，总酚含量用焦没食子酸的重量来表示。

总酚测定方法：取加水适当稀释的果酒样液1.2 mL，加1.0 mL稀释2倍的Folin-Ciocalteu显色剂，加 5 mL，1 mol·L-1碳酸钠溶液，避光放置1 h，测在760 nm下的吸光度。

1.3.3 花色苷含量测定方法

花色苷含量以盐酸矢车菊色素含量表示，盐酸矢车菊色素用0.1 mol·L-1HCl甲醇溶液溶解成100 μg·mL-1储液。取少量该储液，用0.1 mol·L-1HCl-乙醇溶液适当稀释，扫描其吸收光谱，确定其最大吸收波长。

另取储液，用0.1 mol·L-1HCl乙醇溶液配成2.5～20 μg·mL-1溶液。在最大吸收波长下测吸光度，绘制工作曲线。果酒样液用适量0.1 mol·L-1HCl-乙醇溶液稀释，在最大吸收波长下测吸光度。

1.3.4 清除羟基自由基活性测定方法

参照Fenton反应原理及文献[6]等方法进行。在一刻度试管中加1.0 mL，60 mmol·L-1Fe2+，1.0 mL，90 mmol·L-1水杨酸-乙醇，1.0 mL，0.1 mol·L-1HCl-乙醇溶液，定容至10 mL。加1.0 mL，20 mmol·L-1H2O2。10 min后，在波长520 nm下测吸光度，该吸光度记为A0。于另一刻度试管中加1.0 mL，60 mmol·L-1Fe2+，1.0 mL，90 mmol·L-1水杨酸-乙醇，适当稀释果酒加工各阶段样液，定容至10 mL，加 1.0 mL，20 mmol·L-1H2O2，10 min 后，在波长520 nm下测吸光度，该吸光度记为A1。样液在此条件下，有背景颜色，做一不加H2O2的空白，在波长520 nm下测吸光度记为A2。羟基自由基清除率=1-（A1-A2）/A0。

1.3.5 清除氧自由基活性测定方法

邻苯三酚自氧化速率的测定：在25℃的恒温水浴锅中，将 pH 8.2，Tris-HCl缓冲液和 50 mmol·L-1邻苯三酚水浴中分别保温10 min后，取2.8 mL，pH 8.2，Tris-HCl缓冲液，加0.1 mL，50 mmol·L-1邻苯三酚，摇匀，在420 nm下立即测定，每隔0.5 min测1次吸光度（以pH 8.2，Tris-HCl缓冲液为空白），平行试验3次，得3组数据取平均值，根据所测数值绘制时间t-A值曲线。计算抑制率以测定3.0 min平均吸光度（A0）计。

样品抗氧化能力测定：取 2.8 mL，pH8.2，Tris-HCl缓冲液，加待测样品0.1 mL，0.1 mL，50 mmol·L-1邻苯三酚，摇匀，立即同上测定吸光度（A测定）。 同时，取 2.8 mL，pH 8.2，Tris-HCl缓冲液，加适当稀释的果酒加工各阶段样品0.1 mL，加0.1 mL，0.1 mol·L-1HCl。摇匀，测定420 nm下吸光度（A对照），以消除样品颜色影响。抑制率（%）=（A0-A1）/A0×100%。式中，A1=A测定-A对照。

2 结果与分析

2.1 总酚测定标准曲线

总酚测定标准曲线参见文献[7]。

总酚测定标准曲线方程为y=0.032x+0.0197，相关系数R2=0.9988。y为吸光度，x为焦没食子酸溶液（μg·mL-1）。

2.2 花色苷含量测定工作曲线

盐酸矢车菊色素溶液吸收曲线见图2。

图2 盐酸矢车菊色素溶液吸收曲线Fig.2 Absorption curve of cyanidin chloride solution

由吸收曲线得到最大吸收波长为537 nm，所以选用537 nm做测定波长。盐酸矢车菊色素标准溶液工作曲线见图3，该方程为y=0.031x+0.0069。相关系数R2=0.9980。y为吸光度，x为盐酸矢车菊色素浓度（μg·mL-1）。

2.3 果酒加工过程中总酚和花色苷含量变化

本研究在笃斯越桔果酒加工过程中几个主要阶段（原汁、发酵2、7 d、后酵30 d和新酒）监测总酚和花色苷的含量及其抗氧化能力。

笃斯越桔果酒加工过程中总酚和花色苷的含量变化结果见图4、5。

图3 盐酸矢车菊色素标准溶液工作曲线Fig.3 Standard curve for cyanidin chloride solution

图4 笃斯越桔果酒加工过程中的多酚含量变化Fig.4 Change of polyphenol content during wine processing of Vaccinium uliginasum L.

图5 笃斯越桔果酒加工过程中花色苷含量变化Fig.5 Change of anthocyanin content during wine processing of Vaccinium uliginasum L.

其中发酵2 d时，总酚和花色苷的含量比原汁的含量提高近30%，这可能是因为酵母菌和果胶酶的作用使总酚和花色苷进一步浸出的结果。随着发酵的进行，总酚和花色苷的含量逐渐下降，这可能是因为微生物产生的酶促使多酚和花色苷降解。新酒中多酚和花色苷含量较发酵2 d中的分别减少了16.8%和17.4%。

2.4 清除自由基能力变化

在笃斯越桔果酒加工过程中，果酒清除羟基自由基能力和清除超氧自由基能力变化结果见图6、7。新酒清除羟基自由基能力和清除超氧自由基能力较发酵2 d中的分别下降了22.5%和14.9%。总的来说，笃斯越桔果酒加工过程中，果酒清除羟基自由基能力和清除超氧自由基能力和总酚和花色苷含量变化规律一致。

图6 笃斯越桔果酒加工过程中清除超氧自由基能力Fig.6 Change of O2-free radical scavenging activity of Vaccinium uliginasum L.during juice processing

图7 笃斯越桔果酒加工过程中清除羟基自由基能力Fig.7 Change of OH free radical scavenging activity of Vaccinium uliginasum L.during juice processing

2.5 总酚和花色苷含量与清除自由基能力的相关性分析

笃斯越桔果酒加工过程中，果酒总酚和花色苷含量与清除自由基能力的相关性分析结果见图8、9。

由图8、9可知，笃斯越桔果酒加工过程中总酚含量与清除羟基自由基能力相关系数R2为0.9709。总酚含量与清除超氧自由基能力相关系数R2为0.7976。花色苷含量与清除羟基自由基能力相关系数R2为0.9981，花色苷含量与清除超氧自由基能力相关系数R2为0.8544。果酒总酚和花色苷含量与清除羟基自由基能力相关性较好，而果酒总酚和花色苷含量与清除超氧自由基能力相关性略差。

图8 总酚含量与清除自由基能力的相关性分析Fig.8 Relativity ananlysis of content of polyphenol and free radical scavenging activity

图9 总酚含量与清除自由基能力的相关性分析Fig.9 Relativity ananlysis of content of polyphenol and free radical scavenging activity

Solomon等研究发现无花果中花色苷和总酚含量与抗氧化能力有较好的相关性[8]；Xu等研究127种黑大豆中花色苷和总酚含量与抗氧化能力，得出结论，黑大豆种皮中的花青素和总酚是重要的起抗氧化作用的物质[9]。本试验相关性分析数据证明在笃斯越桔中花色苷和总酚含量与清除自由基能力具有相关性。这个结论与张晓松等都柿储放过程中的研究结果一致[7]。

3 结论

总的来说，在笃斯越桔果酒酿制过程中，总酚和花色苷含量主要呈不断减少趋势。随花色苷和总酚含量减少，清除羟基或超氧自由基能力随之减弱。相关性分析数据证明，在笃斯越桔中花色苷和总酚含量与清除羟基自由基能力具有较高的相关性。因此，笃斯越桔果汁中花色苷和总酚是重要的起抗氧化作用的物质。

[1]耿星河,苏亚拉图,敖日格尔,等.笃斯越桔阴干果实的营养成分及其食用价值分析[J].内蒙古师范大学学报:自然科学汉文版,2006,35(2):223-225.

[2]魏金城,刘庆荣.都柿果实成分分析[J].黑河科技,1994(1):7-8.

[3]Dragsted L O,Strube M,Larsen J C.Cancer-protective factors in fruits and vegetables:biochemical and biological background[J].Pharmacol Toxicol,1993,72(suppl.1):116-135.

[4]Genkinger J M,Platz E A,Hoffman S C,et al.Fruit,vegetable,and antioxidant intake and all-cause,cancer,and cardiovascular disease mortality in a community-dwelling population in Washington County,Maryland[J].Am J Epidemiol,2004,160:1223-1233.

[5]曹炜,索志荣.Folin-Ciocalteu比色法测定蜂蜜中总酚酸的含量[J].食品与发酵工业,2003,29(12):80-82.

[6]陈乃东,周守标,王春景,等.春花胡枝子黄酮类化合物的提取及清除羟自由基作用的研究[J].食品科学,2007,28(1):86-91.

[7]张晓松,李冬梅,冯志彪,等.都柿在储放过程中花青素含量变化和抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2008(6):268-270.

[8]Solomon A,Golubowicz S,Yablowicz Z,et al.Antioxidant activities and anthocyanin content of fresh fruits of common fig(Ficus carica L.)[J].J Agric and Food Chem,2006,54(20):7717-7723.

[9]Xu J R,Zhang M W,Liu X H,et al.Correlation between antioxidation and the content of total phenolic and anthocyanin in black soybean accessions[J].Agricultural Sciences in China,2007,6(2):150-158.