番茄Mi-1基因的SNP分型

李亚玲，李景富，康立功，张 贺，董晓慧，许向阳*

（1.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院绥化分院，黑龙江 绥化 152052）

单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）是指染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，而其中最少一种等位基因在群体中的频率不小于1%[1-2]，其中包括单碱基的转换（包括C与T转换，在其互补链上则为G与A互换）、颠换（包括C与A、G与T、C与G，A与T互换），以及单碱基的插入/缺失等。通常所说的SNP并不包括后两种情况，转换的发生率也总是明显高于其他几种变异，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而成为胸腺嘧啶[3-4]。SNP被称为继限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymor-phisms,RFLP）以及微卫星多态性（Micro-satellite polymorphisms）等标记之后的第三代分子标记。

SNP检测分析技术目前主要有阵列杂交分析（Array hybridization assays），基因芯片技术（Gene chips），同源杂交（Homogenous hybridization），限制性酶切法，直接测序法（Direct sequencing）。直接测序检测SNP的基本原理是：通对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较,以确定所研究的碱基是否变异,其检出率可达100%[5]，本试验中的SNP位点即通过直接测序法获得。

SNP分型是SNP研究领域的重要课题。根据不同研究需要和试验条件，已建立了不同的分型方法，包括寡核苷酸连接分析[6-7]、质谱法以及基于PCR的等位基因特异性 PCR（AS-PCR）等[8]。ASPCR法通过特异引物的巧妙设计，PCR对DNA基因组信息的放大和合适的检测方法将不同的SNP基因型分辨开来，具有费用低，程序简单，易于操作等优点，适于中小型研究单位对较小规模SNP检测[9]。目前，改良的AS-PCR方法已有较多报道，如片段长度差异等位基因特异性 PCR（FLDASPCR）、四引物扩增受阻突变体系PCR技术等[10-11]。

本研究试图建立和优化适合于番茄Mi-1基因SNP分型的AS-PCR反应体系，提高这种分型技术在番茄SNP分型中的准确性，为番茄的抗根结线虫Mi基因分子标记连锁作图打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试番茄材料

抗病亲本08576、感病亲本T431以及08576和T431有性杂交的F2代单株。上述材料均由东北农业大学园艺学院番茄课题组提供。通过对这些种质根结线虫Mi-1基因的序列分析，筛选出候选的SNP位点。

1.1.2 供试试剂

CTAB、EDTA、RNase、TaqDNA聚合酶（均购于IBM公司）；Repel、Binding（北京鼎国生物技术公司生产）；DNA Marker、dNTP、引物（由上海生工生物工程和大连生物公司合成或生产）；其他试剂如琼脂糖、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、溴化乙锭、TAE缓冲液等化学试剂（由哈尔滨市宝瑞生物试剂公司和哈尔滨市德美试剂公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

取番茄植株幼嫩叶片，用自来水、蒸馏水冲洗两遍，用灭菌后的滤纸吸干后，每个样本称取0.2 g装入1.5 mL离心管中，用液氮速冻后-20℃保存备用；采用CTAB法对番茄抗病亲本品种08576和感病亲本品种T431以及杂交组合的F2代分离群体各单株分别进行DNA提取。

DNA浓度和质量的测定：用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，λDNA作为Marker，以检查DNA浓度；紫外分光光度计测定样品的纯度，OD260/OD280=1.7～2.0。

1.2.2 等位基因PCR（Allele specific polymerase chain reaction，AS-PCR）

1.2.2.1 引物设计

他们好像不是在分手，为什么这么风轻云淡，没有大吵大闹，没有歇斯底里，没有争吵推诿，或者他们都在等对方先说出来，其实心里早已经对这段感情没有了信心。

试验采用的是原试验数据中一个位于双亲测序片段401 bp的A-T型颠换的SNP突变位点，研究采用了2个平行扩增反应，筛选了3个引物，除都有1个共同上游引物外，另外2个特异下游引物3′末端碱基分别和SNP正常碱基和突变碱基互补，在其3′末端第二或第三碱基分别引入错配碱基增加特异性，引物长度约18～20 bp。用Primer Premier 5软件和Oligo6软件相结合，设计Mi基因特异引物，优化DNA模板浓度梯度、退火温度梯度、引物浓度梯度、dNTP浓度梯度、Mg2+浓度梯度，摸索出扩增效果最佳的PCR程序。

1.2.2.2 PCR扩增

PCR 反应体系为 20 μL，10×buffer 2 μL，引物各 1.5 μL，2 mmol·L-1dNTP 1 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL，DNA 模板 1 μL，5 U·μL-1Taq 酶 0.2 μL。程序为：94℃预变性5 min，（94℃变性1 min，Tm退火1 min，72℃延伸1 min）×35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 SNP基因型检测

PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳即可分辨，2个纯合等位基因型仅一对引物能扩增出单一谱带，同一样本两对特异引物都能扩增出产物为杂合型。

2 结果与分析

2.1 提高SNP特异性的引物设计与筛选

引物3′末端碱基与模板互补则会在适合的条件下发生延伸，否则不能延伸，但是在实际应用中，3′末端单个碱基错配通常不能阻止扩增延伸。因此，Ye等的研究认为[12]，在特异引物3′端1、2位加入错配碱基就可以获得较好的差异产物，并且G/A和C/T错配为强的碱基错配类型；C/A和G/T为弱的碱基错配类型；A/A、C/C、G/G和T/T为中等的碱基错配类型。也就是说：不同嘌呤、不同嘧啶之间的错配分别为强错配，相同嘌呤、相同嘧啶之间的错配分别为中等错配，嘌呤和嘧啶之间的错配为弱错配。在特异引物3′末端错配碱基的搭配方面采取强弱搭配，或者中中搭配，获得理想扩增效果的可能性较大。为了获得较好的特异性条带，根据前人研究经验，本试验针对母本08576和父本T431分别设计了3对反义链引物，这6对引物共用1对正义链引物。

引物S401-1、S401-2、S401-3与母本08576的SNP位点互补匹配，其中，S401-1的3′端第二位引入A/G强碱基错配，S401-2的3′端第三位点引入C/T类型强错配，S401-3为3′端第二位T/G弱碱基错配类型和第三位点采用C/T强错配类型相结合。从PCR效果上看可知，引物S401-3的强弱搭配类型表现出了较好的父母本特异带型（见图1）。

图1 与母本08576的SNP位点匹配的等位基因特异引物的设计与PCR扩增Fig.1 Allele-specific primer designing on the SNP site and PCR results of the parent-08576

引物S401-A、S401-B和S401-C与父本T431的SNP位点互补匹配，其中，S401-A的3'端第二位点引入了A/G强错配类型，S401-B的3'端第三位点引入了C/T的强错配类型，S401-C为第二位点T/G弱配和第三位点C/T强配相结合，但是从PCR效果上看，S401-C在父母本间都扩增出了产物，而仅第二位点引入强错配类型的引物S401-A表现出了良好的特异性（见图2）。

图2 与父本T431的突变SNP位点匹配的等位基因特异引物设计及PCR扩增Fig.2 Allele-specific primer designing on the SNP site and PCR rerults of the parent-T431

2.2 AS-PCR反应体系的优化

等位基因特异PCR非常灵敏，其扩增效果与PCR反应体系中每个组分的用量以及PCR程序都密切相关。其中以引物的退火温度、Mg2+及dNTP浓度的影响较大。在本试验中，先通过引物合成单以及引物设计软件Primer Premier 5推荐的退火温度上下5℃设定梯度，最终确定S401最适温度为48.2℃，同时也对体系中的Mg2+和dNTP浓度进行梯度筛选，得到最佳的Mg2+和dNTP浓度。

本研究使用浓度为25 mmol·L-1的Mg2+设定了5个梯度分别为1～3 μL，以0.5 μL为间隔梯度。结果表明，引物S401-3在1 μL时在两亲本中都没有扩增产物，在2～3 μL时两亲本中都扩增出了产物，但是没有表现出特异性，而1.5 μL时在父母双亲中能扩增出差异的条带，且无杂带；引物S401-A在2～3 μL时都没有表现出引物设计需要的特异性，而在1 μL和1.5 μL时能在亲本中表现出与S403-3相反的特异性，其中1.5 μL时条带更清晰，综合S403-3的扩增情况，选择单次取25 mmol·L-1的Mg2+1.5 μL时浓度为最适 Mg2+浓度，即 1.875 mmol·L-1（见图3、4）。

图3 等位基因引物S401-3在两亲本间的Mg2+浓度筛选Fig.3 Screening of Mg2+concentration of allele-specific primer S401-3 in both parents

图4 等位基因引物S401-A在两亲本间的Mg2+浓度筛选Fig.4 Screening of Mg2+concentration of allele-specific primer S401-A in both parents

本研究中dNTP浓度也是设定了5个梯度分别为1～3 μL，以 0.5 μL为间隔梯度。结果发现，引物S401-3在1.5～2.5 μL时不能表现出亲本间的差异，而在1～3 μL中都表现出了良好的差异；引物S401-A在1.5～3.0 μL都不能表现出亲本间的差异，而1 μL时能表现出与S401-3相反的特异性。从节约成本的角度出发，选定单次取2 mmol·L-1的dNTP 1 μL为最适浓度，即100 μmol·L-1（见图5、6）。

图5 等位基因引物S401-3在两亲本间的dNTP浓度筛选Fig.5 Screening of dNTP concentration of allele-specific primer S401-3 in both parents

图6 等位基因引物S401-A在两亲本间的dNTP浓度筛选Fig.6 Screening of dNTP concentration of allele-specific primer S401-A in both parents

2.3 F2分离群体的SNP分型

利用前面设计的等位基因特异引物及其互补引物，在F2分离群体中进行PCR，以期获得带型相反的PCR产物，即可以相互验证两对引物的正确性。又可以检测该位点在材料中是哪种纯合基因型还是杂合基因型。S401为A/T突变，在亲本T431中T/T纯合型，在08576中为A/A纯合型，因此在F2群体中，仅在S401-3中获得扩增目的片段的为A/A纯合型，仅在S401-A中获得扩增目的片段的为T/T纯合基因型，同时在S401-3和S401-A中获得目的片段的为A/T杂合SNP基因型。由图7可知，F2分离群体中1、4、9、17为纯合的父本基因型T/T型，3、7、13为纯合的母本基因型A/A型，其余单株为杂合A/T基因型。单株12为不明原因的缺失。图7中所示Marker条带从上到下依次为600、500、400。

图7 互补引物检测SNP基因型Fig.7 Assaying SNP genotypes with complementary primers

试验对 438个 F2群体进行 SNP分型，其中能检测出的317株单株的基因型分型结果如表1所示。另外有121株表现为不明原因的缺失。

表1 F2群体基因型检测Table 1 Genotype detection of F2group

查X2值表，当自由度为2时，χ20.05,2=5.991，因此χe2=3.4606＜χ20.05,2，实际检测出的基因分离比与理论分离比1∶2∶1相符合，属于一对等位基因的遗传规律。

3 讨 论

目前国内番茄抗病育种在基因工程方面应用的技术主要有AFLP、RAPD、微卫星技术等第一代、第二代分子标记[13-15]。而SNP密度高，多态性丰富，具有高度遗传稳定性，同时SNP是一种二态的标记，非此即彼，在检测时无需同检测微卫星标记那样对片段的长度做出测量，只需一个“+/-”或“全或无”分析的方式，易于分型，有利于快速、自动化筛选和检测，以及批量、规模筛选和分析[3]。在连锁群体遗传作图方面，具有作为新一代分子标记所特有的价值和意义。

番茄根结线虫病的研究日益重要[16]，根结线虫是番茄重要病害之一，在设施番茄栽培中尤为严重，国外研究报道相继指出，番茄根结线虫抗性是受一个显性基因支配，定名为Mi基因，到目前为止，Mi基因的抗性仍然是目前唯一被鉴定和利用的根结线虫抗性，其抗性具有广谱性，能有效抵抗除北方根结线虫以外的其他3种主要根结线虫。本研究中采用的SNP位点是通过对番茄抗根结线虫Mi基因CDS直接测序发现的。

由于AS-PCR比较灵敏，受PCR体系中dNTP、引物、Mg2+等组分浓度以及退火温度影响较大，若浓度过低，扩增弱，易出现假阴性，浓度太高，导致扩增非特异性，出现假阳性[10-12]。且不同方法和不同SNP位点对PCR参数要求也不一致，所以本研究通过调整PCR组分浓度或改变PCR程序优化PCR效果，获得最适浓度和最适退火温度，解决非特异性扩增。

在等位基因特异引物设计方面，结合了前人的研究成果，首选了第二、三位引入强错配碱基，以及第二、三中强错配碱基搭配的方法增加获得较好差异扩增的可能，节约了成本。从这两个方面保证了SNP特异扩增的准确性。不同的SNP类型采用同样的错配方式设计引物得到PCR效果也不尽相同，这可能与引物末端不同错配碱基产生的碱基堆积力、氢键及其立体结构的稳定性有关。还可能与错配碱基对和DNA聚合酶之间的相互作用造成的空间位阻有关[17]。为了达到更好的PCR特异性效果，需要对不同的碱基错配类型的引物都进行PCR反应体系的优化。

SNP分型试验是为番茄SNP分子标记开发应用提供技术保障；在试验中，利用了SNP的二态性和便于分型的特点[18]，通过等位基因特异PCR针对S401位点设计的互补的引物对F2群体进行了有效的分型（见图7），避免了多重PCR反应条件复杂的制约，适用于样本量适中的分型检测，其互补引物相互验证，琼脂糖电泳即可检测，分型设计简单，可靠。F2群体的SNP分型中，其中已得基因型分离比例经卡方测验符合1∶2∶1的分离比，验证了试验的可靠性，但是还有121株表现为不明原因的缺失，一部分可能是由于DNA降解，另一部分可能由于此位点没有突变，或是其他不明突变所引起等位基因特异PCR产物无条带。

4 结论

研究表明：引入错配碱基和优化PCR反应体系可以调节PCR扩增效果。本试验针对此位点筛选出了特异性最好的与亲本08576的匹配引物S401-3，与亲本T431的匹配引物S401-A。并针对这两对等位基因特异引物筛选了最适的PCR反应体系为：总体积 20 μL，模板 DNA 1 μL，10×Buffer 2 μL，10 μmmol·L-1引物各 1.5 μL，2 mmol·L-1dNTP 1 μL，25 mmol·L-1Mg2+1.5 μL，5 U·μL-1Taq酶0.2 μL。提高了这种分型技术在番茄SNP分型中的准确性。

试验对438株F2群体进行了SNP分型，其中317株获得了基因型，121株由于不明原因缺失，这317株中，表现为母本纯合基因型的70株，父母本杂合基因型的175株，父本纯合基因型的72株，经卡方测验，符合1∶2∶1分离比例，分型结果可靠，为番茄SNP分子标记开发应用提供技术保障。

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