溶菌酶对奶牛子宫内膜炎主要病原的体外药敏试验

中国农业大学动物医学院 章伟建

子宫内膜炎是奶牛生产中的常见病之一，一旦发生，导致奶牛配种困难或长期不孕，养殖效率低，甚至提前淘汰。奶牛子宫内膜炎的直接病因是病原微生物的感染，这些病原微生物包括细菌、真菌、支原体、霉形体、病毒及寄生虫等（吴明楼等，2003）。其中，细菌是引起奶牛子宫内膜炎的主要原因（张来英等，1998）。研究表明，从子宫内膜炎病牛子宫内分离到的细菌主要有葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、假单胞菌、变形杆菌、坏死杆菌、绿脓杆菌、生殖器杆菌、嗜血杆菌等（Thomas，2000；Kudriavtser等，1993；Piddock和Wise，1989），不同地区和不同情况下引起牛子宫内膜炎的细菌种类和各种细菌所占的比例不同。

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶 （程时军和刘金银，2007）。该酶能催化水解细胞壁中位于N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的 β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌（G+），在分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌（G-），如大肠杆菌等。此外，它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能增强抗生素和其他药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。

本试验选取从患有子宫内膜炎奶牛的子宫内黏液中分离出的主要病原菌金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠埃希氏菌和化脓棒状杆菌，在体外用溶菌酶、庆大霉素、氨苄西林和头孢唑啉按照微量肉汤稀释法进行药敏试验,研究溶菌酶对奶牛子宫内膜炎的治疗效果。

1 试验材料

1.1 受试药物与参照药物 受试药物：溶菌酶由上海沈李科工贸有限公司提供。

参照药物：庆大霉素、氨苄西林、头孢唑啉均购自中国药品生物制品检定所。

1.2 试验菌株与参照菌株 试验菌株：从子宫内黏液中分离鉴定后的金黄色葡萄球菌37株，链球菌30株，大肠埃希氏菌12株，化脓棒状杆菌22株。参照菌株：金黄色葡萄球菌ATCC29213，链球菌ATCC49619，购自中国药品生物制品检定所,大肠杆菌ATCC25922，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 培养基与试剂 培养基：MH培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司；产超广谱β-内酰氨酶（ESBLs）检测试剂盒，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；营养琼脂培养基等。

试剂：75%乙醇溶液、无菌0.9%氯化钠溶液、新洁尔灭（1∶1000）溶液。

1.4 实验室器材 操作室：操作室内设有能达到空气消毒的紫外灯。试验前后应用75%乙醇溶液喷洒操作台面及可能污染的死角，开启紫外灯杀菌1 h。器材：可调速旋涡混合振荡器、恒温培养箱、灭菌试管、容量瓶、刻度吸管等、圆底96孔板、接种针或接种环、镍铬丝或一次性无菌塑料制品、无菌衣、裤、帽、口罩，用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无菌物品代替、8头或12头微量加液器、吸头等。

2 试验方法

2.1 β-内酰氨酶检测 金黄色葡萄球菌产β-内酰氨酶检测按碘量法（徐修礼等，2000）进行。

2.2 大肠杆菌产超广谱β-内酰氨酶检测 采用试剂盒进行。

2.3 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的测定 从临床分离的所有金黄色葡萄球菌中，以苯唑青霉素纸片法（1 μg/mL）筛选所有金黄色葡萄球菌，以抑菌圈≤10 mm为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌即MRSA。

2.4 受试药物和参照药物的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定 按微量肉汤稀释法进行，结果参照CLSI/NCCLS标准判定（倪语星等，2005）。

药液配制：头孢唑啉、氨苄西林用pH 6.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液作溶剂配制成1280 μg/mL的储备液，过滤除菌，-20℃低温保存备用。庆大霉素用pH 7.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液作溶剂配制成1280 U/mL的储备液，过滤除菌，-20℃保存备用。溶菌酶用灭菌蒸馏水配制成1280 U/mL储备液，4℃存放，使用当日配制。

菌液制备：质控菌株和鉴定好的试验菌株接种琼脂平板，37℃培养过夜后，挑取1～2个单菌落接种于MH培养液，37℃孵育16～18 h，生长浊度达 5×108～ 7.5×108/mL。 将原菌液作 1∶1000稀释作为试验菌液。

抑杀菌试验：将各种药物储备液依次倍比稀释成 256、128、64、32、16 μg/mL（或 U/mL），用微量加液器将稀释好的药液按浓度梯度分别加入到每一排孔中，每孔50 μL，第12孔加入不含药物的空白溶剂作为阴性对照。用微量加液器将试验菌液依次加入所有试验孔中，每孔50 μL，这样每种药物的最后试验浓度则为 128、64、32、16、8 μg/mL（或U/mL），第12孔加50 μL MH培养液作为阴性对照。混匀，将微量板放置于37℃培养18～24 h后观察结果。以上操作均在无菌条件下。MIC判定：在衬有黑底板的光线下观察，细菌生长使小孔内培养液呈弥散状浑浊或U型底部有圆形或丝网状沉淀；无细菌生长孔的最低药物浓度即为该药物的MIC。MBC测定：MIC测定结束后，取临近MIC值无细菌生长的1～3孔培养物涂于琼脂平板上，37℃培养24 h后观察，平板上无细菌生长对应孔的最低药物浓度为该药物的MBC。

3 结果与分析

溶菌酶以及三种抗生素对从奶牛子宫内黏液中分离的主要病原菌药敏试验结果见表1～4。

由表1可见，溶菌酶对从子宫内黏液中临床分离的金黄色葡萄球菌的MIC为0.004～4 U/mL，MIC50为 0.25 U/mL，MIC90为 1 U/mL；MBC 为125 ～ 8 U/mL，MBC50为 1 U/mL，MBC90为 4 U/mL。溶菌酶对临床分离的金黄色葡萄球菌庆大霉素耐药株、氨苄西林耐药株以及头孢唑啉耐药株的MIC和MBC与敏感菌株无明显差异，且没有发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株。

由表2可见，溶菌酶对从子宫内黏液中临床分离的链球菌的MIC为0.5～8 U/mL，MIC50为2 U/mL，MIC90为 8 U/mL；MBC 为 2 ～ 16 U/mL，MBC50为 4 U/mL，MBC90为 16 U/mL。

由表3可见，溶菌酶对从子宫内黏液中临床分离的大肠埃希氏菌的MIC范围为4～64 U/mL和＞128 U/mL，MIC50为64 U/mL；因本试验数据中MIC大于128 U/mL的菌株数达4株，故无法计算MIC90，初步可判定溶菌酶对临床分离的大肠埃希氏菌很难达到90%的抑菌数，或者是该浓度

大大超过本试验所设计的浓度梯度范围。MBC范围为16～64 U/mL和＞128 U/mL，同样的道理，无法计算MBC50和MBC90。对庆大霉素、氨苄西林及头孢唑啉耐药的大肠埃希氏菌株的MIC与敏感菌株无明显差异；对大肠杆菌产超广谱β-内酰氨酶（ESBLs）株和不产酶株的抑制作用无差别。

表1 溶菌酶以及三种抗生素对奶牛子宫内黏液中分离的金黄色葡萄球菌药敏试验结果

表2 溶菌酶对奶牛子宫内黏液中分离的链球菌药敏试验结果U/mL

表3 溶菌酶对奶牛子宫内黏液中分离的大肠杆菌药敏试验结果

由表4可见，溶菌酶对从子宫内黏液中临床分离的化脓棒状杆菌的MIC为0.5～64 U/mL和＞ 128 U/mL，MIC50为 32 U/mL，MIC90为 64 U/mL；MBC 为 2～128 U/mL和＞ 128 U/mL，MBC50为 64 U/mL，MBC90为 128 U/mL。

表4 溶菌酶对奶牛子宫内黏液中分离的化脓棒状杆菌药敏试验结果U/mL

4 讨论

4.1 溶菌酶对大肠埃希氏菌的弱抑菌力不影响临床效果 由于溶菌酶主要对G+的抑杀作用较强，从本次试验中也表明其大肠埃希氏菌抑杀力不如对其他病原菌强，但临床上由于引起奶牛子宫内膜炎的主要致病菌常常是金黄色葡萄球菌、链球菌、变形杆菌、多杀巴氏杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌等混合菌群（吴明楼等，2003），而不同地区致病菌群中各病菌占取比例并不一样 （王志国等，1998），患病奶牛往往不是由单一的致病菌而是多种病菌侵入而导致的综合性症状 （吴明楼等，1996）。同时，由于对溶菌酶本身的工艺进行了较大的改进，使其对G-也产生了较广的抑菌谱，因此，临床上对于具体的患病奶牛的致病菌群抑杀力不会有明显影响。

4.2 溶菌酶对已经产生抗生素耐药性的病原微生物表现出较好的敏感性 从本次试验中可以发现，溶菌酶对临床分离的金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的庆大霉素耐药株、氨苄西林耐药株以及头孢唑啉耐药株的MIC与敏感菌株无明显差异，对大肠杆菌产超广谱β-内酰氨酶（ESBLs）株和不产酶株的抑制作用也无差别，表明溶菌酶对已经产生抗生素耐药性的病原微生物表现出了较好的敏感性。

4.3 溶菌酶在畜牧业生产中将会有广阔的应用前景 尽管目前对溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段，但是，随着酶工程的发展进步，人们正研究用微生物发酵法生产溶菌酶，同时还采用酶修饰法先后合成了溶菌酶-环糊精和溶菌酶-半乳甘露聚糖，经过修饰后的溶菌酶不仅抗菌活性稳定，而且具有良好的乳化性能。此外，由于溶菌酶抗菌谱较窄，只对G+起作用，为了加强其溶菌作用，常与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐等物质配合使用，以增强对G-的溶菌作用（朱奇和陈彦，1998）。随着杀菌谱广、成本低、安全性高的溶菌酶的开发，溶菌酶在畜牧业生产中将发挥越来越大的作用。

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