缺血性卒中模型大鼠脑组织OMgp的表达及中药干预作用

王中琳

影响缺血性卒中神经再生和重塑的因素主要包括促进因素和抑制因素,而抑制因素在神经再生过程中扮演着更为重要的角色,能否有效解除抑制效应是中枢神经再生的关键[1]。迄今少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)是已发现的主要的抑制轴突生长的蛋白之一。前期研究表明[2],滋补肝肾中药首乌仙海片可诱导缺血性卒中神经功能重塑,促进神经轴突的再生。本研究通过观察首乌仙海片干预局灶性脑缺血模型大鼠脑组织中OMgp含量的变化,进一步探讨中药在脑梗死后脑功能重塑中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物和分组 雄性 SD大鼠240只,体质量250 g～300 g,山东中医药大学实验动物中心提供,合格证号:鲁动质字0002342。240只大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、药物组,并根据脑缺血病程每组又分为3 d、1周、2周、4周、6周共5个亚组,每个亚组各为 12只。

1.1.2 药物与试剂 首乌仙海片主要药物有制首乌、仙灵脾、海马、桑寄生、草决明等,由山东鲁信药业有限公司提供,批号2007030701,并按照成人剂量的20倍[9 g/(kg◦d)]将其制成水溶液,浓度为0.9 g/mL(10 mL/kg),置于4℃冰箱中备用。OMgp单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及处理 按Longa等[3]的方法稍加改进行大脑中动脉闭塞术(MCAO)制作局灶性脑缺血模型。正常对照组:不做任何干预。假手术组:线栓插入颈内动脉但不栓塞大脑中动脉。模型组:线栓法大脑中动脉闭塞造模,不进行药物干预。药物组:行线栓法大脑中动脉闭塞造模,造模成功24 h后给予首乌仙海片。MCAO模型成功的判断标准采用Longa评分标准[3]:0分,无神经缺损表现;1分,对侧前爪不能充分伸展;2分,向外侧转圈;3分,行走时向对侧倾倒;4分,不能行走,意识丧失。动物清醒后进行神经功能评分,1分～3分为纳入标准,0分和4分者剔除。于造模成功24 h后给药,药物组灌胃给予首乌仙海片水溶液10 mL/kg,各对照组分别给予10 mL/kg蒸馏水灌胃,每日1次,每周连续给药6 d,停1 d,并于取材当天停药。在取材的各时间点,3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后,4%多聚甲醛PBS灌注固定取脑,然后将其浸于4%多聚甲醛中后固定。常规脱水浸蜡包埋,予正中隆起水平在切片机上行4 μ m连续冠状切片。

1.2.2 免疫组织化学染色 切片常规脱蜡至水;30%H2O21份+蒸馏水10份混合,室温10 min以灭活内源性酶,蒸馏水洗3次;热修复抗原:将切片浸入 0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0),电炉加热至沸腾后断电,间隔10 min后,反复 1次,自然冷却后用 PBS洗涤2次;滴加 5%BSA封闭液,室温20 min,甩去多余液体,不洗;滴加兔抗鼠OMgp一抗(1∶50),4℃过夜,PBS(pH7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,37 ℃20 min。PBS(pH7.2～7.6)洗2 min×3次;滴加试剂SABC,37℃20 min,PBS洗 5 min×4次;DAB显色:使用DAB显色试剂盒,室温显色,镜下控制反应时间,蒸馏水洗涤;脱水,透明,封片,显微镜观察。免疫组织化学染色阴性对照用生物素化山羊抗兔IgG代替一抗,其余步骤同上,以检查OMgp免疫反应的特异性。

1.2.3 图像分析 切片在统一放大倍数下,随机选10个视野,运用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行分析,记录平均阳性细胞数。

1.3 统计学处理 所得数据经正态分布及方差齐性检验后进行单因素方差分析,数据用SAS 8.1版统计软件进行分析。

2 结 果(见表1)

表2 各组不同时点OMgp表达比较(±s)

表2 各组不同时点OMgp表达比较(±s)

组别 3 d 1周 2周 4周 6周正常对照组 9.19±1.83 7.42±1.24 8.03±1.37 8.46±1.81 9.06±2.82假手术组 8.20±1.27 7.86±1.61 9.14±1.72 8.72±2.02 9.31±1.42模型组 18.61±2.691) 23.62±4.631) 34.04±4.801) 31.65±4.401) 25.23±4.121)药物组 15.41±2.352) 18.81±3.692) 25.00±4.713) 19.77±3.693) 19.62±4.333)与正常对照组同时间比较,1)P＜0.01;与模型组同时间比较,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 讨 论

中枢神经再生失败的主要原因是缺乏适合的微环境[4],抑制轴突再生蛋白的存在是哺乳动物中枢神经系统再生的主要障碍之一,其中损伤后少突胶质细胞髓鞘来源的抑制性蛋白对轴突再生的抑制作用已成为当前轴突再生研究领域的热点之一,现已证实OMgp对轴突再生有显著抑制作用,对其进行有效地干预,能够促进神经重塑,修复缺损的神经功能[5]。

OMgp是少突胶质细胞和髓鞘表面的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白,含有433个氨基酸残基。1990年研究人员用编码OM gp的cDNA克隆筛选人基因组DNA文库,得到了人OMgp基因。通过基因组克隆与分裂中期细胞杂交,将人的OMgp基因定位于17号染色体的q11～12处[6]。进一步的研究结果显示,OMgp基因是 NF1基因的一个内含子,过表达 OMgp的NIH3T3细胞生长速度明显减缓,细胞周期分析发现细胞在G1期受阻,OMgp可阻碍有丝分裂信号途径而发挥生长抑制作用[7],证明了OM gp作为髓鞘相关蛋白能抑制轴突生长,导致生长锥的坍塌。体外培养条件下OM gp对多种神经细胞均有生长抑制作用,如大鼠海马神经元、小脑颗粒细胞、视神经节细胞以及NG108和PC12细胞系等,将OMgp和背根神经节共培养可观察到明显的生长锥崩解现象[8]。Benxiu等[9]通过对OMgp基因敲除的大鼠脊髓损伤后神经再生的观察,发现其轴突再生及神经功能的恢复较野生型大鼠差异有统计学意义,进一步明确了OMgp对轴突再生的显著抑制。

本实验发现,大鼠脑梗死后其脑组织内OMgp在早期即成高表达,并逐渐增高,于2周时达到高峰,2周后逐渐下降,但直至6周时表达也明显高于正常对照组,且各时相OMgp的表达与正常对照组比较有统计学意义(P＜0.01)。可见OM gp在脑梗死后较长时间处于高表达状态,这可能是中枢神经损伤后再生困难的一个主要原因。

近年来有关中药诱导中枢神经再生的研究均是着眼于促进神经生长正性调节因子的表达,而对能否下调抑制因素的表达则鲜有报道。中医学认为,脑梗死的发生病机关键为肝肾亏虚,其治疗也当立足调补肝肾。首乌仙海片由何首乌、仙灵脾、海马等组成,此方补肾精以生髓,补肝木以养春生之气,意在生髓以充脑。本研究探讨首乌仙海片对脑梗死模型大鼠OMgp表达的影响,结果表明,药物组大鼠脑梗死后OMgp在各时相的表达均显著低于同期模型组,说明首乌仙海片可通过抑制神经生长负性调控因子的表达对脑梗死后的神经发生有促进作用。

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