溶血样品对ELISA检测乙肝表面抗原的影响的探讨

杨 艳，陈德平，周 明

（湖南师范大学附属湘东医院，湖南 醴陵 412200）

在临床检测中，常常遇到溶血的标本，而酶联免疫吸附试验 （ELISA）一步法检测乙肝表面抗原（HBsAg）要求标本不能溶血[1],有人认为一定程度的溶血可使从未感染过乙型肝炎病毒的健康者造成HBsAg假阳性[2],为此我们进行下述试验。

1 材料与方法

1.1 仪器

酶标仪(Awareness technologyznc2100),洗板机Statfax-2600。

1.2 试剂

HbsAg检测采用双抗体夹心法HbsAg标准品由湖南省临检中心提供，批号200803；Hb标准液由四川省通广制剂公司提供，HBsAg检测试剂盒上海荣盛生物技术有限公司提供,所有试剂均有效期内使用，按试剂操作说明书进行。

1.3 溶血样品的制备

把血红蛋白标准液加入已离心分离好的正常人血清中稀释成不同程度的溶血样品，如表1所示(其中HbⅠ液为50 g/L的标准Hb液，HbⅡ液为100 g/L的标准Hb 液)。

1.3 统计学方法

数据用χ2检验P＜0.05为显著性意义。

溶血标本检测结果见表2。结果显示，当标本溶血达到一定水平后,才能导致HBsAg结果假阳性。当血液标本为轻度溶血 (1 g/L＜Hb浓度≤5g/L)时HBsAg阳性率很低，P＞0.05，无统计学意义。而Hb浓度≥10g/L时血清中Hb的非特异性吸附造成HBSAg假阳性增高，并且随着Hb浓度增大到20g/L时,假阳性率达到100%，P＜0.001有显著性差异。

表1 溶血标本制备

表2 溶血标本检测结果

3 讨论

溶血是由于各种原因造成红细胞破坏，胞内Hb等物质和细胞内液游离入血清，它对ELISA的影响主要是反应对溶血血清中Hb的非特异性吸附作用。

本结果说明只有当标本溶血达到一定水平后,才能导致HBsAg结果假阳性。当血液标本为轻度溶血(1 g/L＜Hb浓度≤5g/L)时 HBsAg阳性率很低，P＞0.05，无统计学意义，但在实际工作中仍应值得注意。而Hb浓度≥10g/L时血清中Hb的非特异性吸附造成HBSAg假阳性增高，并且随着Hb浓度增大到20g/L时,假阳性率达到100%，P＜0.001有显著性差异。 值得注意的是,由于不同厂家生产的试剂灵敏度可能不太一样,所以不同Hb浓度的溶血标本,测定的HBsAg OD值也可能不同,对HBsAg结果的影响程度也存在一定的差异性[3]。

ELISA中常用的供氢体底物四甲基联苯胺(TMB)经酶作用后由无色变为蓝色,稳定性很好。血红蛋白的亚铁血红素具有弱过氧化物酶样活性,可催化过氧化氢和色原的反应,使TMB氧化呈色。而溶血血清中含有过氧化酶物质 (红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素)，在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它使过氧化氢释放出原生态氧，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性有色物质，即显蓝色，使HBsAg产生假阳性。而随着标本溶血程度的增加,红细胞释放出来的血红蛋白也不断增加,其中的亚铁血红素具有的过氧化酶物质活性也在不断增多,使其氧化呈色反应不断增强,其作用与底物呈现的颜色不断加深。所以不同程度的溶血标本对ELISA法检测的影响程度不同。

另外，ELISA检测HBsAg,反应板孔包被、封闭和洗涤质量不好，操作不正规，都可能引起非特异性吸附的干扰，出现假阳性[4],有报道认为采用手工方法洗板可在一定程度上克服对溶血检测结果的影响[5]。因此，在日常的工作中要求工作人员要严格执行操作规程,特别在采样和处理标本时要小心谨慎,避免标本溶血的发生,避免洗板机堵孔等，或者尝试用二步法进行实验[6],否则将对结果造成影响，给临床带来错误的诊断,造成病人不必要的痛苦和经济损失。

[1]马玲娟,张哓莉,府伟灵,等.影响乙型肝炎表面抗原在ELISA检测中的2种因素分析[J].现代医药卫生,2008,24(16):2493-2494.

[2]张孟斌,杨沛.高中生乙型肝炎病毒表面抗原检测结果分析[J].检验医学与临床,2008,5(5):310-311.

[3]龚显恩.探讨标本溶血对酶联免疫吸附试验检测乙型肝炎表面抗原的影响[J].实用医技杂志,2008,15(14):1821-1822.

[4]单桂秋,苏建婷.溶血及脂浊样品对ELISA检测乙肝表面抗原的影响[J].临床检验杂志,1999,17(2):102-103.

[5]宋炳荣,杜彩霞,崔娜,等,ELISA一步法检测乙型肝炎病毒标志物影响因素的实验研究[J].实用医技杂志,2004,11(9):1836-1838.

[6]陆仁飞.溶血标本对乙型肝炎病毒表面抗原检测结果的影响[J].检验医学与临床,2008,5(17):1065.