节段性骨缺损修复过程中几种微量元素含量的研究

赵益峰,王海滨,孟纯阳,贾存岭,张元民,孔祥清,高峰

(山东济宁医学院附属医院骨科,山东 济宁 272000)

长期以来,在动物实验中对骨折愈合的评价往往主要依靠 X线片和骨痂标本的组织学及组织化学观察[1]。然而,对骨痂愈合的组织学评分方法本身具有很大的主观性,且得到的是统计学上的计数资料,带有一定的局限性,因此需要寻找能定量反映骨折愈合的较为理想、客观的计量指标[2]。有作者实验表明[3],骨痂灰度,骨矿物质含量以及骨的生物力学参数之间有着明显的相关关系,可以对骨折愈合进行综合评价。本实验对节段性骨缺损修复过程中骨矿的几种代表微量元素钙(Ca)、锌 (Zn)、镁(Mg)、铜(Cu)的含量变化作了初步研究,对它们是否可以作为骨折愈合的评价指标提出了初步见解。

1 材料和方法

1.1 兔骨缺损修复材料的制作 7只新西兰大白兔(雄性,2～ 2.5 kg,济南农科院畜牧所种兔厂),取长 1.5 cm尺桡骨共 84枚 ,12枚经-80℃深低温冰箱冷冻、脱水、脱脂、干燥,60CO照射等制成深低温冷冻骨;另 12枚经同样上述程序处理后再在 0.6N盐酸中脱钙等制成深低温冷冻脱钙骨基质;另 60枚制成脱钙骨基质。

1.2 骨缺损支架材料的构建 A1:指上述所制保持完整管状的脱钙骨基质;A2:指 A1一劈为二,1/2旋转 180°与另一半组合;B1:指 A1复合碱性成纤维细胞生长因子 1000IU(将含 1000 IU碱性成纤维细胞生长因子的水溶液 0.1 mL滴入材料髓腔 2 h);B2:指 A2复合碱性成纤维细胞生长因子1000 IU;C1:指髓腔中注满宿主兔的自体骨髓的 A1;C2:空白对照组,指实验兔骨缺损处不植入任何材料;D1:指上述所制的保持完整管状的深低温冷冻脱钙骨基质;D2:指上述所制的保持完整管状的深低温冷冻骨。

1.3 骨缺损动物模型制作、修复材料植入及动物实验设计新西兰大白兔 40只,按完全随机设计的方法分配成四组A、B、C、D,每组 10只,在兔双侧桡骨中上段做 1.5 cm长的节段性骨膜骨缺损模型,A组随机一侧前肢植入上述材料A1,另一侧植入 A2;以此类推,B、C、D组的一侧前肢随机分别植入材料 B1、 C1、D1,另一侧分别植入材料 B2、 C2、 D2。

1.4 实验检测 于手术后第 1、2、4、8、12周各组分别随机杀死 2只实验兔做如下检测。

1.4.1 X线检查 实验兔空气栓塞处死后立即进行双前肢同样条件下 X线片检查。

1.4.2 组织学检测 缺损移植区取材后剔除表面软组织,材料一半多聚甲醛固定,甲酸脱钙,叔丁醇透明,常规石蜡包埋、制片,HE染色,普通显微镜观察。

1.4.3 金属元素含量的测定 取材的另 1/2称重,匀浆,离心,沉淀物用火焰原子吸收分光光度仪行 Ca、Zn、Mg、Cu等金属元素的测定。

1.4.4 统计学方法 金属元素测定结果应用 SPSS10.0软件进行双因素方差分析 (采用 Tukey HSD法或 LSD法),P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

实验期间各组动物均顺利完成预期实验。

2.1 X线检查 术后 12周除 C2空白对照组骨缺损未愈合外,其余各组均达到完全骨性愈合,各组缺损修复区已基本上接近正常桡骨,髓腔已基本上完全再通,尺桡骨间基本上已相互独立。

2.2 组织学检测 术后 12周除 C2空白对照组骨缺损未愈合外,其余各组均达到骨性愈合。板层骨均已转化成稍欠成熟的皮质骨,髓腔已全部再通,骨髓都已转化成成熟骨髓。

2.3 金属元素含量的测定 钙含量的测定结果见表 1。各时间点之间 Ca含量差异具有统计学意义者(P＜0.05,Tukey HSD法 )见于 a、 b间 ,a、 d间 ,b、 c间 ,c、d间 ,见图 1。

锌含量的测定结果见表 2。各时间点间 Zn含量差异具有统计学意义者 (P ＜0.05,LSD法)见于 a、b间,a、c间 ,a、d间 ,a、e间 ,b、e间 ,c、 d间 ,c、 e间 ,见图 2。

镁含量的测定结果见表 3。各时间点间 Mg值含量差异具有统计学意义者(P ＜0.05,LSD法)见于 a、b间,a、d间,b、c间 ,d、 c间 ,见图 3。

铜含量的测定结果见表 4。各时间点间 Cu值含量差异具有统计学意义者(P ＜0.05,LSD法)见于 a、e间,b、e间,c、 e间 ,见图 4。

表1 各时间点各组标本单位湿重 Ca值(μ g/mg)

表2 各时间点各组标本单位湿重 Zn值(μ g/mg)

表3 各时间点各组标本单位湿重 Mg值(μg/mg)

表4 各时间点各组标本单位湿重 Cu值 (μg/mg)

图1 各时间点 Ca值变化

3 讨 论

图2 各时间点 Zn值变化

图3 各时间点 Mg值变化

图4 各时间点 Cu值变化

同种异体脱钙骨基质、同种异体深低温冷冻骨以及自体骨髓均能修复骨缺损,国内外作者已经大量实验证实,用一定的材料将骨缺损部位与周围组织间隔,能够促进骨缺损的修复,此即引导性骨再生理论,也有大量实验证实。基于以上两种骨缺损修复理论,本实验将同种异体的管型脱钙骨基质、管型深低温冷冻骨作保留管型及劈裂不保留管型等构建(见上述材料和方法中兔骨缺损修复材料的制作以及骨缺损支架材料的构建),观察到术后 12周时除 C2空白对照组骨缺损未修复外,其余各组无论从 X线片表现、取材术中所见以及组织学表现均显示骨缺损已经较好的修复,当然在术后不同时间点各不同修复材料的修复进度仍表现出较大的差别。各种不同条件下骨缺损修复过程中,微量元素 Ca、Zn、Mg、Cu的变化规律及其与骨缺损修复进程的相关性探讨如下。

钙是骨的主要金属元素之一,骨缺损修复后骨痂的多少,换言之钙含量的多少可以直接说明骨修复的程度。我们对实验中不同支架材料在不同时间点所修复的缺损标本全部予以钙含量测定 ,结果见表 1。从图 1可以看出,术后 2、8、12周各材料的钙含量均较术后第 1周有明显的提高,但术后第 4周钙含量明显较第 2周降低,之后又明显提高,这和有关作者[4]骨痂钙在整个骨折愈合期均稳定的报道不符。分析原因,可能术后第 4周末各材料正达编织骨期向板层骨期转化的高峰,此时需要髓腔的整合与贯通,钙大量分解吸收,造成此期钙含量下降;之后前期板层骨及板层骨钙开始大量沉积,致使钙含量自 4周末开始上升,8周末达高峰,8周末后进入塑形期,少量不在力线上的骨质被吸收,导致 8周末后钙含量轻度下降,但总的趋势是材料移植后钙含量逐渐增加。基于上述原因,钙作为评价成骨活性大小的指标,取材应有时间限制,应避开编织骨向板层骨转化的高峰期。

在骨形成和代谢过程中,三种代谢酶类即碱性磷酸酶、胶原酶和碳酸酐酶起着重要作用,锌是三种酶的重要辅助因子。 Haumont在 1961年就报告锌主要集中在钙化前的类骨质中,这与骨中碱性磷酸酶最大含量一致。缺锌时,主要是碱性磷酸酶的含量受到影响。 Zorrilla等[5]发现血清锌过低的髋部骨折患者愈合受到影响,血锌值可以作为髋部骨折患者能否愈合的预测指标。国内学者蓝文正等[4]对 72只家兔桡骨进行试验性骨折,发现锌在骨折处的代谢高于对侧相应部位的水平,且骨锌在第 4周出现高峰值,表明骨愈合过程中局部锌代谢是旺盛的。锌对破骨细胞的形成具有潜在的抑制作用,并与其他抗骨吸收因子如降钙素、雌二醇相同,抑制作用发生于骨髓细胞分化的晚期。锌可能是破骨细胞膜质子泵的抑制剂,对骨吸收具有直接的抑制作用。我们对骨缺损修复区内骨组织的锌含量进行测量,从中试图得到有益的信息(见表 2)。从统计数据来看,骨锌在第 2周末就达到第一个高峰值(P＜0.05),一直维持同一水平持续到第 4周末。之后骨锌值继续升高,到第 8周末到达第二个峰值(P＜0.05),之后基本上维持在此水平 (见图 2),这和有关作者[4]的观察同样有出入。另外,统计分析还可以看出 ,对不同材料间的骨锌值进行比较得出一个有趣的现象:越是成骨活性较好的材料其骨锌均数值越低,越是成骨活性较差的材料其骨锌均数值越高,这和已知的骨锌值的作用似乎正好相反,其中的原理有待进一步明确。并且骨锌值是否可以作为一个评价材料成骨活性的指标(骨锌值高则材料成骨活性低、骨锌值低则成骨活性高)还有待于我们进一步探究。

Mg是机体一种必需元素 ,是多种酶的激活因子,可激活多种水解酶、合成酶、激酶和羟化酶,参与三磷酸腺苷的依赖性反应,影响蛋白质、核酸合成。 Ryder等[6]发现白种人较多摄入镁后其骨矿量明显增高。翟照等[7]通过对家兔行骨折部位自体骨髓移植,发现实验侧骨痂量明显多于对照侧,同时骨痂中镁含量亦高于对照侧。我们对各种不同支架材料修复骨缺损后不同时间点骨痂中的镁含量作了测定(见表 3),结合 X线、组织学检测,以期发现两者间是否具有某种程度的相关性。从统计数据可以看出,骨缺损区材料移植后第 2周末骨镁值达高峰(P＜0.05),之后未像骨锌值那样维持同一水平至第 4周,而是到第 4周末下降至第一周时的水平(P＜0.05),之后又继续升高,至第8周末升至第二个峰值(P＜0.05),之后基本上维持这一峰值但也有所下降(P＞0.05)(见图 3),这种变化和 Ca的变化趋势极其相似(见图 1)。另外我们还发现,不同的移植材料其骨镁值出现的变化与骨锌值相似,即越是成骨活性较好的材料其骨镁值越低,越是成骨活性较差的材料其骨镁值越高,这和有关作者[7]做的实验结果相反,其原理有待于阐明,且骨镁值可作为成骨活性检测指标也有待于明确。基于与钙相同的原因,其取材时间也应受类似的限制。

Cu是体内必需的微量元素,是骨和酶系统的重要组成部分,是骨愈合中最活跃的因素[4],是某些酶的激活物质,铜借助这类酶对成骨细胞起激活作用。翟照等[7]在家兔自体骨髓移植骨痂铜含量检测中发现,骨髓移植后 2周实验侧高于对照侧,推测可能为铜促进胶原纤维交联,同时发现这种作用仅限于骨髓移植术后的 2周内 ,术后 6周时骨痂中铜达峰值,两侧无显著性差异。我们在本实验中对各时间点各组的缺损区标本均作了铜含量测定(见表 4),并对其进行统计学处理,结果和上述实验的检测结果不相同。统计显示,各组材料移植术后第 1、2、4周骨铜水平很稳定,直到第 4周末才有轻度上升 (P＞0.05),第 8周末后骨铜水平明显上升,至 12周末达峰值(P＜0.05)(见图 4)。12周后是否还上升,因我们的实验最后一批取材在第 12周末 ,结果还不清楚。从本资料来看,铜并非骨缺损修复过程中的活跃元素,它不适于作为成骨活性的检测指标。

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[5]Zorrilla P,Salido JA,L′opez-Alonso A,et al.Serum zinc as a prognostic tool for wound healing in hip hemiarthroplasty[J].Clin Orthop Relat Res,2004,(420):304-308.

[6]Ryder KM,Shorr RI,Bush AJ,et al.Magnesium intake from food and supplements is associated with bone mineral density in healthy older white subjects[J].J Am Geriatri Soci,2005,53(11):1875-1880.

[7]翟照,陈凤苞.家兔自体骨髓移植对骨痂中钙镁铜含量的影响 [J].中国骨伤 ,2002,15(2):82.