灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠大脑皮质及海马区 PCNA变化的影响

吕艳婷,王淑秋,宋立德

(1.浙江省诸暨市人民医院病理科,浙江诸暨 311800;2.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)

癫痫(Epilepsy EP)是一组由大脑神经元高度同步化异常放电所引起的短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病,具有突然发生、反复发作,可自然缓解的特点[1]。癫痫的病因 ,发病机制,演变过程十分复杂,迄今尚未完全明确。目前,针对癫痫发病机制的研究表明,作为神经系统重要组成成分的神经胶质细胞(AS)在中枢神经系统病变中扮演重要角色,几乎所有的癫痫病例手术切除标本及动物实验模型中均可见到神经胶质细胞的增生。 AS是中枢神经系统中主要的大胶质细胞,对神经元的营养,支持,修复,再生起到重要作用,同时对有害刺激产生强烈反应,因此,AS的反复增殖活化与癫痫的发生演变的密切相关性越发受到重视。我国药用植物资源丰富,灵芝孢子粉作为一种名贵中草药,含有丰富的营养物质,如氨基酸及微量元素等,能有效调节机体免疫力 ,清除氧自由基,增加耐低氧能力,降脂,保肝 ,抗衰老,抗肿瘤,并能稳定膜离子通道,减轻钙超载,而且对神经系统还具有镇静和保护功能,降低受损伤神经元的死亡率[2～6]。本实验通过对 PCNA的检测,探讨灵芝孢子粉对戊四氮致痫大鼠中枢神经系统星形胶质细胞增殖活化的影响,进一步研究癫痫发病机制及灵芝孢子粉作用机制,为寻找合理有效抗癫痫药物提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性 Wistar大鼠 30只,体重(200±20)g,购自佳木斯大学实验动物中心,随机分为对照组、癫痫模型组和灵芝孢子粉干预组,每组各 10只。

1.2 模型制备

癫痫模型组和灵芝孢子粉干预组用亚惊厥剂量的 PTZ(35mg/kg体重)腹腔注射,注射时浓度为 10g/L,每日 1次,持续 28d,同时对照组以等容生理盐水腹腔注射;灵芝孢子粉干预组经灌胃给予灵芝孢子粉(150mg/kg体重),灌胃时浓度为30g/L;同时癫痫模型组和对照组以等容生理盐水灌胃。

1.3 行为学观察

每天对每只大鼠在 PTZ注射后进行观察并记录癫痫发作的潜伏期 ,发作级别及持续时间,用药 28d后停药一周 ,再用相同剂量的 PTZ测试,凡出现连续 5次Ⅱ级以上痫性发作为达到点燃标准。

1.4 免疫组织化学

实验动物麻醉后断头处死,在低温条件下迅速取脑,中性甲醛固定包埋,用切片机在视交叉后 2mm,按 5 μm每层进行冠状切片,制片后备用。 0.3%H2O2室温孵育15min,以消除内源性过氧化物酶的活性;抗原修复;山羊血清封闭;依次加一抗 (兔抗大鼠 PCNA多克隆抗体 ,1:100,北京博奥森生物技术有限公司),37℃水浴箱孵育 90min;AP标记的生物素化山羊抗兔 IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司),37℃孵育 20min;试剂 SABC37℃孵育 20min。 DAB显色 (2～ 5min,PCNA阳性反应产物为棕黄色,位于胞核),脱水,透明,封片。光镜下观察。

1.5 Western-blot

动物分组与模型制备同步骤一、二,冰上迅速分离海马,冰上匀浆 10min,加入裂解液裂解 30min,4℃下 12000rpm离心 15min,取上清备用。蛋白定量测定后 ,蛋白样品采用 10%的 SDS-PAGE进行电泳分离,然后转至 PV DF膜作免疫反应。浸入封闭液 4℃过夜,然后依次加入适宜浓度的兔抗大鼠PCNA多克隆抗体,37℃孵育 2h,适宜浓度的生物素化的山羊抗兔 Ig G抗体 37℃孵育 1h,BCIP-NBT显色(1:50,武汉博士德生物工程有限公司)。各反应间用缓冲液充分洗涤。拍摄滤膜图片留作永久性实验记录,用凝胶图象处理系统分析目的条带的分子量和净光密度值。

1.6 图像分析及统计学处理

每只实验动物标本随机选择 4个切面,每张切片随机选择5个400倍视野(共20个视野 /只 ),记录每 400倍视野阳性细胞数用 BI-2000医学图像分析系统分析 PCNA免疫反应性,Western-blot结果用 GIS凝胶图像处理系统分析 ,实验中所得计量资料数据结果均以(平均数±标准差)表示 ,多组之间的比较用方差分析,显著性水准为 0.05,使用 SPSS for Windows 11.5统计软件包进行统计。

2 结果

2.1 行为学观察

对照组无痫样发作,癫痫模型组有重度的痫样发作(Ⅳ～Ⅴ级),灵芝孢子粉干预组有轻度的痫样发作(Ⅰ～Ⅱ级),与癫痫模型组动物相比,灵芝孢子粉干预组大鼠潜伏期明显延长,发作级别降低,少有大发作。

2.2 PCNA免疫组化结果

癫痫模型组大脑皮质及海马 PCNA免疫反应阳性细胞数比空白对照组明显增多,差异具有显著性 (P＜0.01),灵芝孢子粉组大脑皮质及海马 PCNA免疫反应阳性细胞数比癫痫模型组明显减少 ,差异具有显著性 (P ＜0.01)。(见表1与图 1,图 2)。

表1 大脑皮质和海马区PCNA阳性细胞数的变化(± s,n= 10,个 /400倍视野 )

表1 大脑皮质和海马区PCNA阳性细胞数的变化(± s,n= 10,个 /400倍视野 )

注:*与空白对照组比较,P＜0.01;#与癫痫模型组比较,P＜0.01。

组 别 皮 质 海 马空白对照组 10.20± 1.312.23± 0.48癫痫模型组 61.10±3.78* 35.30±2.21*灵芝孢子粉组 21.80±1.93# 8.60±1.07#

2.3 Western-blot检测海马区 PCNA蛋白含量

PCNA分子量为 36KD,内参为43KD。空白对照组海马区 PCNA表达量很少,PT Z致痫后大鼠大脑海马区 PCNA表达量明显增加,差异有显著性(P ＜0.01),灵芝孢子粉干预组 PCNA表达量与癫痫模型组相比较明显减少,差异有显著性 (P ＜ 0.01)。(见表2,图 3)。

表2 海马区 CyclinD1与 PCNA蛋白含量变化 ±s,n=10)

表2 海马区 CyclinD1与 PCNA蛋白含量变化 ±s,n=10)

注:与空白对照组比较,* P＜0.01;与癫痫模型组比较,#P＜0.01。

空白对照组 0.18±0.050.17±0.01癫痫模型组 0.56± 0.06* 0.59±0.01*灵芝孢子粉组 0.36±0.04# 0.38±0.02#

图 3 大脑海马区 PCNA蛋白含量变化

3 讨论

AS是中枢神经系统重要的组成部分,其不仅发挥营养支持及协助代谢的功能同时参与 CNS的信息传递与整合。PCNA是一种核内蛋白质,是 DN A聚合酶δ的辅助蛋白[7,8],可以与 CDK抑制剂 P21、CyclinD1和 CDK结合形成复合物 ,并能刺激 CyclinD1-CDK复合物对DN A连接酶的磷酸化,从而参与正常的 DN A复制、细胞周期的转变和受损 DNA的切除修复过程,与细胞的增殖周期密切相关,其表达程度反映了细胞增殖活性的高低,是反映细胞增殖情况应用最普遍的抗原标记。本实验免疫组化结果显示,癫痫模型组与空白对照组相比较 PCNA阳性细胞数明显增多,表明细胞增殖活性增强。而灵芝孢子粉治疗组 PCNA阳性细胞数明显低于癫痫模型组。 Western-blot检测结果与免疫组化相同,显示灵芝孢子粉对PTZ致痫模型皮质和海马胶质细胞的增殖活性有抑制作用。中医药治疗癫痫历史悠久,其中灵芝孢子粉具有调节免疫、提高机体耐缺氧能力,稳定膜离子通道,减轻钙超载,对神经系统也有镇静和保护功能,从而激活机体内在的抗损伤机制。综上所述,灵芝孢子粉具有抑制PTZ致痫大鼠模型 PCNA表达和胶质细胞增殖活性、减轻痫样发作的程度和抑制痫样放电的作用,但其具体作用机制仍有待进一步研究。灵芝孢子粉的这些作用可能在防治癫痫的发生发展和复发方面具有重要意义。

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