艾芬地尔对脑缺血再灌注大鼠A IF表达及神经元凋亡的影响

王彦平 杨金升 范 磊 张明磊 司江华 曲传勇

近期研究表明,细胞凋亡在脑损伤后的神经细胞死亡中起重要作用[1]。本实验对局灶性脑缺血再灌注大鼠给予艾芬地尔治疗,应用脱氧核糖核苷酸末端标记法(term inal deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL)及免疫组化染色法,比较假手术组、对照组与艾芬地尔组之间神经元凋亡与AIF的表达,探讨艾芬地尔对缺血再灌注后神经细胞凋亡的影响,为其治疗脑缺血提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 健康雄性W istar大鼠66只,鼠龄3～4个月,体重250～320 g,由甘肃省中医学院实验动物中心提供,并随机分为：假手术组6只,对照组和艾芬地尔组应用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,缺血时间为2 h,再灌注时间为6、24 、48、72、168 h,每个时间点为 6 只大鼠。剔除死亡和蛛网膜下腔出血大鼠后,随机补充以满足每组实验只数。

1.2 材料与试剂 A IF兔多克隆抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司),即用型SABC免疫组化染色试剂盒(购自北京中杉生物技术有限公司),TUNEL凋亡检测试剂盒(购自Roche公司)。

1.3 局灶性脑缺血再灌注模型的建立

模型制作根据Nagasaw a等的改良线栓法制成大鼠大脑中动脉缺血模型[2]。简要过程如下：用10%的水合氯醛(30mg/100 g体重)腹腔注射麻醉大鼠后,将其仰卧固定,分离右侧颈总动脉(CCA),颈内动脉(ICA)及颈外动脉(ECA),结扎 ECA与CCA近心端,用微型动脉夹夹闭CCA远心端后,迅速于ECA与ICA分叉下方约5 mm处剪一小口,将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙鱼线(直径0.175 mm)插入颈内动脉,插入深度为(18.5±0.5)mm,直到有轻微阻力感为止,实现大脑中动脉阻塞缺血;结扎插线入口处,尼龙鱼线外留约1 cm,缝合皮肤;2 h后轻轻提拉所留线头至略有阻力,实现大脑中动脉再灌注,造模完成;动物清醒后出现 Horner征,提尾右前肢屈曲或爬行向左侧转圈者为手术成功标志。假手术组除插线1 cm外,其余步骤同对照组。

1.4 给药剂量及方法 艾芬地尔注射液由重庆人本拉思药业有限公司提供(5 mg/支)。艾芬地尔组大鼠于缺血再灌注前30 min给予腹腔注射艾芬地尔注射液10 m g/kg,此后每天腹腔注射药物1次,直至大鼠处死,假手术组和对照组根据体重同步注射相应剂量的生理盐水。

1.5 标本采集和组织切片的制备 假手术组于手术后24 h取材,其余各组在相应时间点取材。用10%的水合氯醛(30 mg/100 g体重)腹腔注射麻醉大鼠后,经左心室插管,剪开右心耳,依次灌注生理盐水、40 g/L多聚甲醛各300 m l,断头取脑,置入40 g/L多聚甲醛固定12 h,于视交叉后1～4 mm之间取材,厚约3 mm,常规石蜡包埋,冠状面连续取材,取齿状回与海马互包平面的切片,片厚6μm 。

1.6 AIF的免疫组化标记 免疫组化采用SABC法。石蜡切片脱蜡至水,放入柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中,微波热修复15 min,3%H2 O2 37°孵育 10 min,10%山羊血清封闭,37°孵育 10 min,倾去血清,勿洗,滴加1∶200兔抗鼠A IF抗体,4℃冰箱孵育过夜,37℃复温1 h,滴加适量生物素标记山羊抗兔二抗工作液,37℃孵育20min;滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃孵育15 min。除血清封闭外,其余步骤间均用PBS冲洗3次,每次5 min;DAB显色剂显色2～5 m in;自来水冲洗,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;显微镜下观察细胞核中出现棕黄色颗粒者为AIF阳性细胞。阴性对照取PBS代替一抗,免疫反应阴性,说明一抗的特异性较强。

1.7 凋亡细胞检测 按照TUNEL试剂盒提供的实验步骤进行操作。用二甲苯浸洗2次,每次5 min;用梯 度酒 精(100%、95%、90%、80%、70%)脱水,每次3 min;PBS漂洗 2次,每次5 min;用细胞通透液(0.1%T riton X-100溶于蒸馏水,临用前配制)37℃反应8～10min;PBS漂洗2次;制备体积比为 1∶9的 TdT和荧光素标记的 dUTP TUNEL反应混合液混匀;玻片干后加50μl TUNEL混合液(阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液)于标本上,在暗湿盒中反应(37℃×1 h);PBS漂洗3次;加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450～500 nm,检测波长为515～565 nm)并照相;玻片干后加50μl converter-POD在37°暗湿盒中反应33min,PBS漂洗3次;在组织处加50μl新鲜配制的DAB底物,室温下反应5～10 min;PBS漂洗3次;每次漂洗为5 m in;苏木素复染50秒后立即用自来水冲洗;梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。光镜下观察出现棕黄色颗粒为阳性(凋亡)细胞。显微镜下观察顶叶皮质缺血半暗带,取5个非重叠视野,以计数凋亡细胞数/视野。

2 结 果

2.1 AIF的表达 A IF阳性细胞呈棕黄色,假手术组大鼠脑组织中未见明显AIF阳性细胞。对照组与艾芬地尔组各亚组A IF阳性细胞数在缺血再灌注6 h开始升高,48 h达到高峰,随后下降;对照组与艾芬地尔组在相同时间点及其组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05,表1)。

2.2 凋亡细胞检测 DAB显色后出现棕黄色颗粒者为凋亡细胞,正常细胞核无着色,主要在缺血周围区,假手术组未见明显的凋亡细胞。对照组与艾芬地尔组各亚组大鼠凋亡细胞数在缺血再灌注6 h开始升高,48 h达到高峰,随后下降;对照组与艾芬地尔组在相同时间点及其组间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05,表2)。

表1 大鼠缺血再灌注后AIF阳性细胞数的变化(±s,n=6,个/每 200倍视野)

表1 大鼠缺血再灌注后AIF阳性细胞数的变化(±s,n=6,个/每 200倍视野)

注 ：与对照组比较,*P＜0.05

AIF阳性细胞数组别I/R 6 h I/R 24h I/R 48h I/R72h I/R 168 h对照组 74.87±7.17 124.53±9.09 130.47±11.32 84.13±8.96 30.27±4.79艾芬地尔组 61.87±5.73*91.93±7.75*103.87±9.80*71.87±7.80*23.20±4.76*

表2 大鼠缺血再灌注后凋亡细胞数的变化(±s,n=6,个/每 200倍视野)

表2 大鼠缺血再灌注后凋亡细胞数的变化(±s,n=6,个/每 200倍视野)

注 ：与对照组比较,*P＜0.05

组别 凋亡细胞数I/R 6 h I/R 24 h I/R 48 h I/R72 h I/R 168 h对照组 58.03±6.41 102.50±9.54 118.53±11.67 76.20±8.11 23.33±5.16艾芬地尔组 48.30±5.09*81.33±8.29*92.27±9.39*65.93±7.58*16.70±4.16*

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤的发生是多种因素及多种机制参与的复杂病理生理过程,细胞凋亡是脑缺血再灌注后神经元损伤死亡的一种重要形式。由于通过药物可以干扰某些环节,抑制凋亡通路,达到保护神经元缺血性损伤的目的,所以选择药物干预,通过观察其对神经元凋亡及调控凋亡因子的影响,判断其对神经元的保护作用,可为指导临床治疗脑梗死提供理论依据。

细胞凋亡的发生涉及到能量的减少、兴奋性氨基酸毒性、钙离子超载、自由基释放、线粒体的损伤等,但就其机制来说有caspase依赖途径及AIF介导的非caspase依赖途径。AIF是近年来发现的一种凋亡效应分子,它是一种在进化上较为保守的黄素蛋白,定位于细胞线粒体膜间隙,具有凋亡诱导的活性。A IF是一种双功能蛋白,具有氧化还原酶的活性,与线粒体的生理活动有关[3],它在不依赖caspase途径的细胞凋亡过程中扮演重要角色。

凋亡的发生既与凋亡相关基因表达有关 ,又受许多因素的调节。在众多因素中兴奋性氨基酸受体的过度激活是引起缺血神经元死亡的主要因素 。兴奋性氨基酸毒性不仅引起神经元急性坏死 ,同时也诱导细胞凋亡,其机制可能与NMDA受体的激动有关,有研究表明慢性NMDA的应用可增加促凋亡因子和减少抑凋亡因子的作用[4]。谷氨酸是缺血后兴奋性氨基酸中早期释放的氨基酸,并且是哺乳动物中枢神经系统兴奋性氨基酸的主要成份[5],谷氨酸的结合位点是由NR2B组成的,因此可以说NR2B亚基在凋亡通路中起关键作用。有研究表明,激动NR2B亚基可增加神经元凋亡,在脑卒中前及脑卒中4.5h内应用NR2B受体拮抗剂可减少梗死体积[6]。体外培养的大鼠前脑的原始细胞用十字孢碱诱导凋亡,结果只有20%的细胞存活,用选择性NMDA受体NR2B亚基拮抗剂干预时细胞存活率可高达78%,选择性NR2B受体拮抗剂可明显提高细胞存活率[7]。

艾芬地尔为NMDA受体NR2B亚基选择性受体阻滞剂,并且艾芬地尔的药物疗效具有剂量依赖性[8]。因此,适量艾芬地尔的应用可以抑制谷氨酸的兴奋性毒性,阻止其继发的一系列病理生理变化。本实验结果表明艾芬地尔使AIF表达减弱,凋亡细胞明显减少,可能机制为NMDA受体NR2B亚基激活后,继发钙超载,自由基、一氧化氮升高,炎症介质的释放等,最终导致线粒体的损伤,使PT通道开放,CytC及A IF释放到胞质中[9,10]。CytC引发caspase家族成员活化,引起细胞凋亡,AIF分子带有核定位序列,引导AIF向细胞核转位,引起DNA的片段化反应[11],导致细胞凋亡;应用选择性NR2B受体拮抗剂艾芬地尔可以抑制谷氨酸的兴奋性毒性,使AIF释放减少,抑制AIF介导的细胞凋亡,并且可减少NR2B亚基的表达[12],从而起到脑保护作用。

1 Lossi L,M erighi A.Invivo cellu lar and molecular mechanisms of neuralapoptosis in themammalian CNS.Pro Neurobiol,2003,69(2)：287-312.

2 Nagasaw a H,Kogu re K.Correlation betw een cereb ral blood flow and histologic changes in a new ratm odel ofm iddle cerebrlartery occlusion.Stroke,1989,20(8)：1037-1043.

3 Porter AG,U rbano AG.Does apoptosis-indu cing factor(A IF)have both life and death functions in cells?Bioessays,2006,28(8)：834-843.

4 K im HW,Chang YC,Chen M,et al.Ch ronic NMDA adm inistration to rats increasesb rain pro-apoptotic factors w hile decreasing anti-Apoptotic factors and causes cell death.BMC Neurosci,2009,10(9)：123.

5 A rundineM,Tym ianskiM..Molecularm echanisms of glu tamatedependent neu rodegeneration in ischem ia and traumatic b rain injury.JCell Mol Life Sci,2004,61(6)：657-668.

6 Liu Y,W ong TP,Aarts M,et al.NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo.JNeurosci,2007,27(11)：2846-2857.

7 Williams AJ,Dave JR,Lu M,et al.Selective NR2B NMDA receptor antagonists are protective against staurosporine-induced apoptosis.Eur JPharmacol,2002,452(1)：135-136.

8 Chen M,Lu TJ,Chen XJ,et al.Differential roles of NM DA receptor subtypes in ischem ic neuronal celldeath and ischem ic tolerance.Stroke,2008,39(11)：3042-3048.

9 Sanges D,M arigo V.Cross-talk betw een tw o apoptotic pathw ays activated by endoplasm ic reticulum stress：differential contribution of caspase-12 and AIF.Apoptosis,2006,11(9)：1629-1641.

10 Lu PH,Kung FL,Kuo SC,et al.Investigation of an ti-tumor m echanisms of K 2154：characterization of tubulin isotypes,m itotic arrest and apoptotic machinery.Naunyn Schm iedebergs A rch Pharmacol,2006,374(11)：223-233.

11 Cregan SP,Daw son V L,Slack RS.Role of A IF in caspase-dependent and caspase-independen t cell death.On cogene,2004,23(16)：2785-2796.

12 ZhangW,Shi CX,Gu XP,et al.Ifenprodil indu ced an tinociception and decreased the expression of NR2B subunits in thedorsal horn after chronic dorsal root ganglia compression in rats.Anesthesia&Analgesia,2009,108(3)：1015-1020.