黄芪甲苷对脑缺血再灌注后血脑屏障的保护作用及occludin蛋白表达的影响

曲友直 赵燕玲 李 敏 高国栋

血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)的破坏可导致血管源性脑水肿,是脑缺血再灌注损伤后脑水肿的重要病理基础[1,2]。毛细血管内皮细胞之间的紧密连接是BBB结构和功能的基础[3],咬合蛋白Occludin是内皮细胞之间紧密连接的重要结构蛋白,其水平的高低与BBB的开放、关闭关系密切。黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分,常作为黄芪及含黄芪(君药)的中成药定性定量评价的指标[4,5]。已有研究表明黄芪甲苷具有减少脑缺血再灌注后脑组织白细胞浸润、抗炎性反应、减轻脑水肿等作用,但目前作用机制尚不明确。本研究通过观察黄芪甲苷对大鼠脑缺血再灌注后脑组织含水量、伊文氏蓝(Evans Blue,EB)含量及咬合蛋白occludin表达的影响,以探讨其对BBB的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 黄芪甲苷(中国药品生物制品检定所,批号：110781-200613)。伊文氏蓝购自美国Sigma公司。Occludin蛋白免疫组化试剂盒购自美国Zymed公司。医学图像分析系统,型号 Olym pus BX-51。健康成年雄性SD大鼠,体重250～300 g,购自本校实验动物中心。

1.2 检测方法 72只SD大鼠随机等分为4组,每组18只。A组为假手术组,栓线仅插入颈总动脉6 mm,不阻塞大脑中动脉,其余步骤同B组;B组为生理盐水对照组,参照Zea Longa报道的方法[6],采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。结扎大鼠颈总和颈外动脉,自颈总动脉分叉处向颈内动脉插入栓线约(18.5±0.5)mm,阻断大脑中动脉血流,造成局灶性脑缺血,大脑中动脉闭塞即刻经腹腔注射等体积生理盐水;术后将栓线尾部置于皮下,缺血1.5 h后轻拔栓线造成血流再灌注24 h;C组为小剂量黄芪甲苷治疗组,大脑中动脉闭塞即刻经腹腔注射黄芪甲苷10 mg/kg;D组为大剂量黄芪甲苷治疗组,大脑中动脉闭塞即刻经腹腔注射黄芪甲苷20 mg/kg。再灌注24 h后每组随机取6只大鼠断头取脑称湿重,放入烤箱内干燥24 h后称干。脑组织含水量按以下公式级算：脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重。每组中另外6只大鼠于处死前1 h经股静脉缓慢注入2.5%伊文氏蓝生理盐水0.2 m l/100 g。再灌注24 h时开胸经左心室灌注生理盐水,断头取脑称重后放入甲酰胺中浸泡,收集浸泡的甲酰胺溶液,用分光光度计(620～680 nm)测得其吸光度,计算脑组织中EB含量。每组其余6只大鼠,在术后相应的时间点水合氯醛深度麻醉后,自左心室灌注生理盐水200 m l冲净血液,500 m l4%多聚甲醛溶液固定大鼠各组织,断头取脑;将标本在4%多聚甲醛溶液中后固定24 h;鼠脑自额极至枕叶分为A、B、C、D、E 5等份,取 C 脑片在恒温冰冻切片机上做厚度为15μm的冠状面位切片,进行免疫组化染色。免疫组化染色用图像分析系统采集照片,在400倍视野下每张切片在梗死灶周围随机选取10个视野,计数免疫组化阳性血管。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0软件包。各组实验值均以±s来表示,组间差异采用方差分析,同组间两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

与A组相比,B组大鼠脑组织含水量、伊文氏蓝含量明显增多,occludin蛋白免疫组化阳性血管的数目显著减少(P＜0.01);与B组相比,C组和D组大鼠脑组织含水量、伊文氏蓝含量显著减少,occludin蛋白免疫组化阳性血管的数目显著增加(P＜0.05)。C组和D组比较,脑组织含水量、伊文氏蓝含量及occludin蛋白免疫组化阳性血管的数目无显著差异(P＞0.05)(表1)

表1 黄芪甲苷对大鼠脑缺血再灌注后脑组织含水量、伊文氏蓝含量及occludin蛋白表达的影响

3 讨 论

脑水肿是脑缺血再灌注损伤的基本病理变化之一,也是导致病情加重、甚至引起患者死亡的常见病因。血脑屏障的破坏可导致血管源性脑水肿,是脑缺血再灌注损伤后脑水肿的重要病理基础[1,2]。细胞间紧密连接是一组复杂蛋白质构成的复合体。咬合蛋白(occludin)是细胞间紧密连接复合体的重要结构蛋白。咬合蛋白作为一种跨膜蛋白,其氨基端和羟基端位于细胞内,两个环形结构位于细胞外,这两个向细胞外伸出的环形结构与临近细胞膜上occludin伸出的环形结构紧密相连,进而封闭彼此间细胞间隙。其胞内的氨基端和羟基端与膜相关鸟苷激酶样闭锁小带蛋白(zonula occludens protein,ZO-1)紧密连接,再通过ZO-1与细胞骨架连接在一起,在细胞膜上得到固定并保持其连续性[7]。

本实验结果表明,大、小剂量黄芪甲苷均可降低脑缺血再灌注后脑组织含水量及伊文氏蓝含量。正常情况下伊文氏蓝进入体内后与血清白蛋白结合不能通过BBB,脑缺血再灌注后由于BBB破坏、通透性增加。伊文氏蓝会通过血管壁进入脑组织,因此伊文氏蓝可作为示踪剂对BBB破坏进行定量评价[8]。本研究结果显示,大鼠脑缺血再灌注模型建立后脑内含水量及伊文氏蓝含量显著增加,表明在缺血再灌注损伤中血脑屏障结构遭到破坏,通透性显著提高;使用黄芪甲苷治疗后脑组织内含水量以及伊文氏蓝含量明显降低,提示黄芪甲苷能够减轻缺血、缺氧造成的BBB通透性改变,减少蛋白漏出,一定程度上降低了脑细胞的水肿程度,遏制脑缺血病程的发展,从而发挥对脑缺血的保护作用。

本实验结果还表明,大、小剂量黄芪甲苷均可上调脑缺血再灌注后occludin蛋白的表达水平。脑缺血再灌注后毛细血管内皮细胞occludin表达显著降低,使内皮细胞间不能形成紧密连接复合体,进而导致BBB紧密连接的破坏和血管源性脑水肿的产生[9]。应用黄芪甲苷治疗后表达降低的occludin显著上调,提示黄芪甲苷可通过减少脑缺血再灌注后occludin蛋白的损失,维持紧密连接复合体结构的完整性,进而起到了保护血脑屏障的作用,这可能是黄芪甲苷发挥对脑缺血再灌注后血脑屏障保护作用的机制之一。

本研究结果还发现,大剂量黄芪甲苷治疗组与小剂量黄芪甲苷治疗组相比较,缺血再灌注后脑组织含水量、伊文氏蓝含量及occludin蛋白的表达无显著差异,说明黄芪甲苷对BBB的保护作用在一定范围内与剂量大小无明显关系,机制尚不清楚,本研究推测这可能与脑缺血再灌注 后血脑屏障破坏与多因素调控有关。

1 Nordal RA,W ong CS.Molecular targets in radiation-induced blood-brain barrier disruption.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2005,62(1)：279-287.

2 Begley DJ,Brightman MW.Stru ctural and function aspects of the blood-brain barrier.Prog Drug Res,2003,61(1)：39-78.

3 Ge S,Song L,Rachter JS.Where is the blood-brain barrier really?JNeurosci Res,2005,79(4)：421-427.

4 胡芳弟,封士兰,赵键雄,等.HPLC法测定黄芪中黄酮类成分和黄芪甲苷的含量.分析测试技术与仪器,2003,9(3)：175-177.

5 秦海林,赵天增,高令洁,等.人参皂苷与黄芪甲苷的薄层色谱分析.中国中药杂志,1995,20(4)：226-227.

6 Longa EZ,W einstein PR,Carlson S,et al.Reversib le m iddle cereb ral artery occ lusion w ithou t caniectomy in rats.Stroke,1989,20(1)：84-91.

7 Matter K,Balda MS.Functional analy sis of tight junctions.Methods,2003,30(3)：228-234.

8 Ikede Y,W ang M,Nakazaw a S.Sim ple quantitative evaluation of blood brain barrier disrup tion in vasogenic b rain edema.Acta Neu rochir,1994,60(suppl)：119-120.

9 Mark KS,Davis TP.Cereb ralm icrovascular changes in permeability and tight junctions induced by hypoxia-reoxygenation.Am JPhysiol H eart Cire Physiol,2002,282(6)：H 1485-H 1494.