丹红注射液对大鼠脑缺血再灌注神经细胞凋亡的影响

范 磊,杨金升,石向群,张明磊,王彦平,司江华,曲传勇

丹红注射液由红花和丹参科学提取精制而成,主要成分为红花黄色素、丹参酮和丹参酚等[1,2],具有活血化瘀、通脉舒络之功效,临床上用于治疗心脑血管等多种疾病。有研究表明[3,4],丹红注射液有保护血管内皮,促进血管再生及抑制血管内凝血和促进纤溶活性的功能,但关于丹红注射液影响脑缺血后神经细胞的凋亡机制还缺少翔实的实验研究。为此本文通过建立大鼠局灶性I/R损伤动物模型,观察丹红注射液对脑缺血周围区Caspase-3、Survivin及神经细胞凋亡的影响,旨在探讨其对实验性脑梗死脑保护作用的初步机制,为临床合理用药提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 局灶性脑缺血模型制作 采用线栓法制作大鼠脑缺血模型。选用Wistar大鼠,雌雄各半,体重280 g～320 g。腹腔内注射水合氯醛(0.03 mL/kg)麻醉,实现大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)。维持肛温在37℃左右,保持呼吸道通畅。大鼠大脑中动脉梗死后2 h,参照改良的Bedersonps评分方法进行神经功能缺失评分[5],选择评分在2分～3分的动物进行下一步实验。

1.2 动物分组与处理方法 将96只大鼠随机分为假手术组、模型组、丹红注射液治疗组(治疗组),再各分为缺血 2 h再灌注6 h、24 h、48 h、72 h四个亚组,每个亚组8只大鼠。其中丹红注射液治疗组于脑缺血造模成功后30 min腹腔注射丹红注射液,模型组给予等量生理盐水,剂量5 mL/kg,每日1次,治疗至各不同时间点处死取材。

1.3 标本采集和组织切片的制备 在大鼠脑缺血2 h再灌注6 h、24 h、48 h、72 h各个时间点,用 10%的水合氯醛深度麻醉动物后,经左心室插管至升主动脉,并剪开右心耳,用生理盐水250 mL快速冲洗,随后用4%多聚甲醛PBS液先快后慢灌注约250 mL固定,断头取脑,在4%多聚甲醛PBS液中固定24 h～28 h,在视交叉前后约2 mm冠状切取约4 mm厚脑组织切块,置于含4%多聚甲醛PBS液中固定过夜,脱水、包埋成蜡块。

1.4 Caspase-3和Survivin的检测 按SABC免疫组化试剂盒说明书(北京博奥森生物技术有限公司)进行操作。DAB显色,苏木素复染。用PBS代替一抗作为阴性对照。Caspase-3、Survivin均以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性反应产物。用Image-proplus 5.0软件,对每张切片大脑皮质缺血灶周围区Caspase-3和Survivin的表达进行光密度值检测。

1.5 细胞凋亡的检测 细胞凋亡检测严格按TUNEL试剂盒说明书(美国罗氏公司)进行操作。DAB显色,苏木素复染。光镜下神经元胞核中有棕黄色颗粒的为阳性,用Image-proplus 5.0软件,对每张切片大脑皮质缺血灶周围区TUNEL阳性细胞的表达进行光密度值检测。

1.6 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件包进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用重复测量的单因素方差分析(post-way RANOVA)比较组间差异,进一步post-hoc分析采用LSD比较两组间差异。

2 结 果

2.1 大鼠神经功能评定结果 大鼠麻醉清醒后出现右侧Honer征,左侧前肢不能伸展,走路向左侧转圈或向左侧倾倒,神经功能评分2分～3分的大鼠入组。肢体瘫痪症状以缺血2 h再灌注6 h～24 h最显著。

2.2 Caspase-3表达检测结果(见表1)缺血侧大鼠脑组织缺血灶周围区于再灌注6 h即有大量Caspase-3阳性细胞表达,再灌注24 h表达进一步增加,再灌注48 h有所下降,再灌注72 h继续下降。与模型组比较,再灌注各个时间点治疗组光密度值明显降低(P＜0.05)。

表1 各组大鼠缺血侧(右侧)Caspase-3光密度值的比较(±s)

表1 各组大鼠缺血侧(右侧)Caspase-3光密度值的比较(±s)

组别 n 6 h 24 h 48 h 72 h假手术组 8 0.06±0.02 0.06±0.02 0.06±0.02 0.05±0.02模型组 8 0.20±0.031) 0.34±0.051) 0.25±0.041) 0.18±0.031)治疗组 8 0.14±0.042) 0.30±0.052) 0.22±0.052) 0.13±0.032)与假手术组比较,1)P＜0.05;与模型组、假手术组比较,2)P＜0.05

2.3 Survivin表达检测结果(见表2)缺血侧大鼠脑组织缺血灶周围区于再灌注6 h即有部分Survivin阳性细胞表达,再灌注24 h表达进一步增加,再灌注 48 h达到高峰,再灌注72 h有所下降。与模型组比较,再灌注各个时间点治疗组光密度值明显升高(P＜0.05)。

表2 各组大鼠缺血侧(右侧)Survivin光密度值的比较(±s)

表2 各组大鼠缺血侧(右侧)Survivin光密度值的比较(±s)

组别 n 6 h 24 h 48 h 72 h假手术组 8 0.04±0.01 0.07±0.02 0.08±0.02 0.07±0.02模型组 8 0.15±0.031) 0.21±0.041) 0.31±0.041) 0.24±0.031)治疗组 8 0.18±0.042) 0.31±0.042) 0.45±0.052) 0.33±0.042)与假手术组比较,1)P＜0.05;与模型组、假手术组比较,2)P＜0.05

2.4 T UNEL检测结果(见表3)TUNEL阳性染色为细胞核呈棕黄色颗粒,主要见于缺血灶周围区,于再灌注6 h、24 h表达进一步增加,再灌注48 h有所下降,再灌注72 h继续下降。与模型组比较,再灌注各个时间点丹红注射液治疗组光密度值明显降低(P＜0.05)。

表3 各组大鼠缺血侧(右侧)TUNEL阳性细胞光密度值的比较(±s)

表3 各组大鼠缺血侧(右侧)TUNEL阳性细胞光密度值的比较(±s)

组别 n 6 h 24 h 48 h 72 h假手术组 8 0.06±0.01 0.07±0.02 0.06±0.02 0.06±0.02模型组 8 0.33±0.031) 0.44±0.031) 0.33±0.041) 0.21±0.021)治疗组 8 0.25±0.042) 0.33±0.052) 0.26±0.042) 0.17±0.032)与假手术组比较,1)P＜0.05;与模型组、假手术组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

脑缺血再灌注后神经细胞凋亡机制是一个复杂的多因素过程,对细胞凋亡机制的探讨及阻止凋亡的发生有重要的现实意义。Caspase-3在细胞凋亡过程中居核心地位,是细胞凋亡的关键蛋白酶,在各种程序启动的凋亡程序中起最后枢纽作用[6]。活化的Caspase-3可通过切割 PARP、Actin、Fodrin、Lamin等底物,最终使细胞凋亡[7]。有研究表明,和正常大鼠相比,Caspase-3基因敲除的大鼠脑缺血2 h再灌注48 h后,皮层的梗死体积降低了55%,TUNEL阳性细胞密度下降了36%,说明Caspase-3在脑缺血再灌注细胞损伤中发挥了重要作用。另有文献报道,在缺血缺氧性脑损伤及脑缺血再灌注损伤中,应用Caspase-3抑制剂可有效地减少脑缺血后神经元凋亡的数量,从而起到脑保护作用[8,9]。以上研究结果说明Caspase-3参与了缺血性脑损伤,并在缺血神经元的凋亡过程中发挥重要作用。

Survivin属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族中的一员,是近来发现的凋亡抑制基因。目前的研究表明,Survivin主要通过以下途径抑制细胞凋亡:一是通过直接抑制各种凋亡途径的终末效应蛋白Caspase-3和Caspase-7的活性从而阻断细胞凋亡过程[10,11]。二是发现Survivin能与周期蛋白激酶Cdk4及p34cdc2相互作用从而阻断凋亡信号转导通路。Survivin依赖细胞增殖信号进入核内与Cdk4结合,导致p21从Cdk4中释放出来,p21易位到线粒体与procaspase-3结合,抑制 Caspase-3的活性,从而抑制细胞凋亡。另外,Survivin与p34cdc2结合磷酸化后,与Caspase-9结合并抑制其活性,阻断Caspase-9依赖性的细胞凋亡信号传导,抑制Caspase-3的活性,抑制细胞凋亡[12,13]。

本实验研究发现,大鼠缺血2 h再灌注各个时间点模型组Caspase-3、Survivin和T UNEL阳性细胞的表达明显增加,给予丹红注射液治疗后,治疗组脑缺血2 h再灌注各个时间点与模型组相比Caspase-3、TUNEL阳性细胞表达明显降低,Survivin表达明显增加,提示丹红注射液可能通过促进脑缺血后Survivin的表达,抑制Caspsae-3的表达,从而抑制 I/R诱导的脑细胞凋亡,最终对脑缺血损伤起到神经细胞保护作用。但丹红注射液作用于Caspase-3及Survivin的具体机制及是否通过其他方面发挥作用,还有待进一步研究。

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