大黄素对脑缺血再灌注大鼠的保护作用及机制研究

谭 力,王联英,向海鹰,李 鸣

卒中是现代社会致死致残的主要病因之一,其中缺血性卒中占70%以上。但目前除了超早期溶栓治疗外,尚无被证明疗效确切的药物[1],因此寻找有效的脑缺血保护药物成为研究的热点。大黄素(Emodin)化学名称1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌,已有文献报道其具脑缺血保护作用,机制与其对缺血后的炎症因子的抑制作用有关[2]。但相对于脑缺血损伤复杂的机制,其保护作用及机制的探讨尚不全面。本实验拟采用脑缺血再灌注大鼠模型,在整体和微观层面观察大黄素的保护作用,并通过观察大黄素对缺血后神经元凋亡的影响,进一步探讨作用机制,以期为大黄素的运用提供更充实的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物分组 健康雄性SD大鼠45只,体重250 g～320 g,由湖北民族学院医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组、缺血再灌注组、大黄素组,每组15只。假手术组不作任何处理,缺血再灌注组采用线栓法行大脑中动脉阻塞,大黄素组在术前30 min给予大黄素25 mg/kg腹腔注射。

1.1.2 试剂 水合氯醛(中国,国药试剂),大黄素,焦油紫,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(美国,Sigma),TUNEL检测试剂盒(德国,Roche),caspase-3活性检测试剂盒(上海,碧云天)。

1.1.3 仪器 光学显微镜(日本,Olympus),电子分析天平(德国,Sartorius),Ultrospec 4000紫外分光光度计(加拿大,SpectraLab Scientific),高速冷冻离心机(美国,Beckman),石蜡切片机(德国,Leica)。

1.2 方法

1.2.1 脑缺血再灌注模型制作 参照Zea longa[3]的大脑中动脉线栓法,采用水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg,IP)麻醉大鼠后,分离出左颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,微动脉夹暂时夹闭颈总动脉和颈内动脉,在颈外动脉两结扎线间剪一小口,将线栓(栓头涂有硅胶,直径0.28 mm)经切口插入颈外动脉、颈内动脉,一直进入17 mm～19 mm时会遇到轻微阻力感,此时结扎备用线将线栓固定在颈外动脉,缝合皮肤。2 h后拔出线栓形成再灌注。假手术组不插入尼龙丝线,其他操作步骤同上。造模成功标准:同侧即刻出现Honer征,对侧肢体功能障碍。

1.2.2 神经功能缺陷评分 参照Zea longa[3]的方法,缺血2 h再灌注后24 h进行神经功能缺陷评分。评分标准:0分,无功能障碍;1分,不能伸展前肢;2分,向一侧旋转;3分,向一侧倾倒;4分,无自主活动伴意识抑制。不足1分者为造模不成功。

1.2.3 脑梗死体积 采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(T TC)染色。缺血2 h再灌注后24 h水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠断头取脑,切成厚度为2 mm的脑片,置于2%TTC染液中37℃避光染色15 min,计算机图像处理系统测量每一脑切片尾侧面的梗死面积,将各脑片的梗死面积之和乘以脑片厚度,即为整个梗死灶的体积。

1.2.4 组织病理染色 石蜡切片制作,Nissl染色,TUNEL染色,采用TUNEL试剂盒,按说明书步骤操作。高倍镜(×400)下每张切片随机选取5个视野,进行阳性细胞计数。

1.2.5 Caspase-3活性 采用Caspase-3活性检测试剂盒,缺血2 h再灌注24 h取大鼠脑组织水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,按照每3 mg～10 mg组织加入100μ L裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5 mL离心管中,冰浴再裂解5 min,4℃16 000 g离心10 min～15 min后,把上清转移到冰浴预冷的离心管中,分光光度计测定Caspase-3的活性。

2 结 果

2.1 大黄素减少脑梗死体积及神经功能缺陷评分 与假手术组比较,缺血再灌注组有明显的神经功能缺损及梗死灶形成。而大黄素则能显著改善缺血引起的神经功能缺损,减少脑梗死体积,提示大黄素具有脑缺血保护作用。详见表1。

表1 各组神经功能缺陷评分、脑梗死体积比较(±s)

表1 各组神经功能缺陷评分、脑梗死体积比较(±s)

组别 n 神经功能缺陷(分)脑梗死体积假手术组 5 0 0缺血再灌注组 5 2.82±0.21 181.45±19.37大黄素组 5 2.06±0.141) 120.52±14.501)与缺血再灌注组比较,1)P＜0.01

2.2 大黄素减轻脑组织损伤 Nissl染色显示假手术组脑组织无水肿、充血,脑组织呈均匀一致的紫蓝色,细胞密度大,神经元形态结构完整,为三角形、长条形或多边形,胞浆染色清晰,尼氏体着蓝色,胞核淡染,无明显神经元丢失;缺血再灌注组大脑皮层可见较明显的充血,血管周围间隙增宽,细胞间质水肿,神经元皱缩体积缩小,与周围组织脱离,胞核固缩深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,部分神经元肿胀,胞浆呈空泡状;大黄素组可见少量神经元肿胀,少量神经元皱缩、胞核固缩深染,细胞密度较大,与模型组比较神经元损伤减轻、丢失减少,提示大黄素改善脑缺血损伤。

2.3 大黄素减少神经元凋亡 缺血 2 h再灌注24 h的TUNEL染色结果表明,假手术组仅见极少量TUNEL阳性细胞,而缺血再灌注组的阳性细胞数则显著增多,大黄素组的阳性细胞数明显减少,提示大黄素对缺血再灌注后的神经元凋亡具有抑制作用。详见表2。

表2 各组T UNEL阳性细胞计数比较(±s)

表2 各组T UNEL阳性细胞计数比较(±s)

组别 n T UNEL阳性细胞计数(细胞数/视野)假手术组 5 8.4±2.4缺血再灌注组 5 87.5±11.3大黄素组 5 33.9±6.01)与缺血再灌注组比较,1)P＜0.01

2.4 大黄素抑制Caspase-3活性 缺血2 h再灌注24 h的结果表明,缺血导致Caspase-3活性显著升高,从假手术组的0.12±0.07上升到缺血再灌注组的1.33±0.25,大黄素组则显著降低至0.56±0.11,表明大黄素对缺血引起的Caspase-3活化及其活性升高具有抑制作用。

3 讨 论

通过整体和微观研究,观察了大黄素的脑缺血保护作用。大黄素能显著改善缺血2 h再灌注24 h的神经功能缺陷评分,减少脑梗死体积,显著减轻缺血引起的脑组织损伤。

脑缺血损伤是由脑血流减少或中断引起的,缺血引起的神经元死亡包括坏死和凋亡两种途径[4]。坏死多发生于较严重的缺血以及缺血中心,而凋亡多发生于较缓和的缺血以及缺血周边(或缺血半暗带),缺血周边的细胞可存活数小时甚至数天,因此抑制神经元凋亡有利于改善脑缺血损伤[1]。动物实验表明多种凋亡抑制剂通过抑制缺血周边或者缺血半暗带的细胞凋亡而减少脑梗死体积,进而促进神经功能的改善[5]。目前已知细胞凋亡级联反应包括细胞外病理途径(死亡受体途径)和细胞内病理途径(线粒体途径)两种途径。这两种途径都最终依赖于Caspase-3的活化,Caspase-3在凋亡级联反应中处于核心地位,是凋亡的最终执行者[6]。Caspase-3通常以无活性的酶原形式存在,在上述两种途径下被活化,因此抑制Caspase-3活性就能抑制凋亡的发生,多种Caspase-3抑制剂的运用以证明了这一点[7]。本研究于缺血2 h再灌注24 h检测了大鼠的神经元凋亡,以及Caspase-3的活性,结果表明大黄显著减少脑缺血区的TUNEL阳性细胞,而这一结果与Caspase-3活性的降低有关。

大黄素能改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺陷评分,减少脑梗死体积,减少神经元凋亡,而这一作用与大黄素对Caspase-3活性的抑制作用有关。

[1]巫志峰,罗翠霞,孙静,等.大黄素对缺血性中风大鼠脑组织NF-κ B、ICAM-1基因表达的影响[J].中国中医急症,2009,18(6):934-936.

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[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]Dirnagl U,Iadecola C,M oskowitz MA,et al.Pathobiology of ischaemic stroke:An integ rated view[J].Trends Neurosci,1999,22(9):391-397.

[5]Lei B,Popp S,Capuano-Waters C,et al.Lidocaine attenuates apoptosis in the ischemic penumbra and reduces infarct size after transient focal cerebral ischemia in rats[J].Neuroscience,2004,125(3):691-701.

[6]Ferrer I,Planas AM.Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:Life and death struggle in the penumbra[J].J Neuropathol Ex p Neurol,2003,62(17):329-339.

[7]Brien T,Lee D.Prospects for caspase inhibitors[J].Mini Rev Med Chem,2004,4(2):153-165.