三七总皂苷对缺氧再给氧血管内皮细胞NF-κ B及ICAM-1表达的影响1)

江小萍,李海全,潘少霞,方永奇,刘桂娥,欧阳永红,沈祖泓

随着溶栓、冠状动脉腔内成形术及冠脉搭桥术等再灌注治疗在临床的广泛开展,心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemic reperfusion injury,MIRI)越来越受到临床的重视,减轻或避免MIRI的发生是溶栓、冠状动脉腔内成形术及冠脉搭桥术成功的关键,也是目前冠心病治疗领域的热点问题之一。三七总皂甙(total panax notoginseng saponins,tPNS)是我国中药田三七的主要药用成分,具有对抗心肌缺血-再灌注损伤、钙拮抗、心肌保护等[1]作用,但其分子机制并不完全明确。本研究以人脐静脉内皮细胞株(ECV304)为研究对象,模拟心肌缺血再灌注环境,通过检测血管内皮细胞缺氧再给氧损伤(hypoxia/reoxygenation,H/R)后超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)和核转录因子(nuclear factor kappa-B,NF-κ B)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达及 tPNS干预后SOD、GSH、MDA 和NF-κ B、ICAM-1表达的变化,从血管内皮细胞损伤的角度探讨M IRI和tPNS保护作用的机制,为MIRI提供中医药治疗的方法。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养液 ECV304细胞株(中山大学细胞库);RPMI-1640培养基(美国GIBCO);胎牛血清(美国GIBCO)。

1.2 主要试剂与仪器 SOD、MDA及GSH测定试剂盒(南京建成生物工程研究所),单克隆抗体 CD54-PE、IgG-PE(美国PharMingen),flour-3/AM(美国 Biotium),流式细胞仪(美国BECKM AN COULTER公司ALTRA型),四色荧光,配套EXPO32采集分析软件,MultiCycle分析软件。

1.3 细胞培养及分组 将培养的ECV304细胞分为7组,正常组:未予H/R及药物干预处理;模型组:予 H/R处理;三七总皂苷高剂量组:3.125 1 mg/L;三七总皂苷中剂量组:1.563 1 mg/L;三七总皂苷低剂量组:0.781mg/L;吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组:PDTC 100 μ mol/L;维拉帕米组:100 μ mol/L维拉帕米;除正常组、模型组外其余5组分别与药物共同孵育1 h后制作H/R模型。

1.4 H/R模型的制作 将生长至稳定状态的ECV304细胞置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱正常培养 1 h,放入 37℃、5%CO2、95%N2的培养箱培养1.5 h,取出置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱正常培养2 h[2],用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA-Na2混合液消化收集各组细胞。

1.5 氧自由基清除功能测定 收集各组细胞培养上清液,按试剂盒操作步骤测定SOD、MDA和GSH。

1.6 内皮细胞 NF-κ B P65表达 各组 PCAEC爬片,每组 8个样本,4%多聚甲醛固定,一抗为NF-κ B P65兔多克隆IgG抗体,稀释比例为1∶200;余步骤按试剂盒操作步骤进行。胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞,每个样本任选6个视野进行阳性细胞计数,阳性率用阳性细胞数占同一视野ECV304细胞数的百分比表示。每个样本的阳性率取不同视野阳性率的平均值。

1.7 内皮细胞ICAM-1的表达 收集的单个细胞,PBS洗两次,离心去上清,加入CD54-PE单克隆抗体各 10 μ L,室温孵育30 min后,PBS重悬细胞,流式细胞仪检测,其结果以阳性百分率表示。每份样本均设阴性对照(加相应IgG抗体),以消除本底荧光的影响。

1.8 统计学处理 SPSS 11.5统计分析软件对数据进行处理,数据以均数±标准差(±s)表示,两组比较采用t检验。

2 结 果

2.1 SOD活性、MDA及GSH的含量(见表1)正常组细胞氧自由基清除功能无明显改变;模型组,tPNS高、中、低浓度组,维拉帕米组及PDTC组细胞SOD活性、GSH含量明显低于正常组;MDA的含量明显高于正常组。tPNS高、中、低浓度组细胞SOD活性、GSH含量明显高于H/R组同期,MDA含量明显低于H/R组,且呈浓度依赖性改变,tPNS高浓度组细胞SOD活性、GSH含量明显高于维拉帕米组及PDTC组,MDA的含量明显低于维拉帕米组及PDTC组。

2.2 NF-κ B、ICAM-1表达的变化(见表1)正常组细胞NF-κ B及 ICAM-1表达无明显改变;模型组、tPNS高、中、低浓度组、维拉帕米组及PDTC组细胞NF-κ B及ICAM-1表达明显高于正常组,其中 tPNS高、中、低浓度组细胞NF-κ B及ICAM-1表达明显低于H/R组,且呈浓度依赖性改变;tPNS高浓度组细胞NF-κ B及ICAM-1表达明显低于维拉帕米组及PDTC组。

表1 各组ECV304 NF-κ B、ICAM-1表达,SOD、MDA、GSH含量比较(±s)

表1 各组ECV304 NF-κ B、ICAM-1表达,SOD、MDA、GSH含量比较(±s)

组别 SOD(U/mL)MDA(nmol/mL)GSH(mg/L)NF-κ B ICAM-1(%)正常组 11.89±1.58 0.13±0.08 97.73±10.69 3.47±0.92 4.33±0.91 tPNS高剂量组 10.33±2.461) 3.38±0.481) 84.92±8.211) 23.93±7.411) 28.14±2.781)tPNS中剂量组 9.72±1.991) 3.50±0.321) 79.23±8.531) 29.59±5.621) 34.25±4.381)tPNS低剂量组 8.34±1.931) 3.49±0.361) 72.10±6.601) 32.56±3.881) 39.05±4.101)模型组 6.86±3.021) 6.69±0.791) 58.53±4.971) 54.80±5.151) 80.01±2.641)维拉帕米组 9.24±1.791) 3.29±0.531) 79.38±8.641) 24.39±6.471) 34.98±5.001)PDTC组 9.88±2.121) 3.42±0.361) 79.50±9.011) 25.92±5.161) 36.84±4.341)与正常组比较,1)P＜0.05

3 讨 论

血管内皮细胞不仅是血液与血管壁之间的屏障,更是重要的内分泌器官和效应器官,通过释放和合成多种血管活性因子,在血管自稳态的调节中发挥着重要作用。在心肌缺血再灌注过程中,由于大量氧自由基的产生,血管内皮细胞被激活,激活的内皮细胞能表达多种细胞黏附分子,它引起的急性炎症反应影响内皮和心肌细胞的结构、功能和代谢[3]。NF-κ B是一系列前炎症基因激活的共同途径,对心肌再灌注损伤的发生起着重要的作用[4]。直接或间接抑制NF-κ B活化均可减轻缺血再灌注损伤[5,6]。

传统中药三七主要药用成分为tPNS,具有散癖止血,消肿定痛功效。历代医家对其药用价值都给予了高度评价。目前认为tPNS对抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制主要是:抗氧自由基损伤;抗脂质过氧化;抑制钙通道防止钙超载;提高心肌SOD活性;增加心肌营养血流量等[7]。三七总皂苷能否减轻缺氧复氧血管内皮细胞的损伤并不完全清楚。本研究采用ECV304作为研究对象,结果表明在缺氧-再给氧时,血管内皮细胞被激活,细胞氧自由基清除功能明显降低,NF-κ B及ICAM-1的表达升高,用三七总皂苷预处理后,细胞氧自由基清除功能明显改善,NF-κ B的活性明显被抑制,同时伴有ICAM-1表达的下降,且呈浓度依赖性,提示tPNS可有效地抑制 NF-κ B、ICAM-1表达,明显改善细胞氧自由基清除功能,减轻缺氧再给氧引起的细胞损伤。此结果为进一步探讨缺血再灌注损伤对心功能造成损害的作用机制,寻求中医药治疗缺血再灌注损伤的新途径奠定了基础。

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