胃癌组织中端粒酶检测及血清癌胚抗原及癌抗原125检测的临床意义

范丽梅,刘国辉,于金海

(1.长春市宽关区医院,吉林长春130051;2.吉林大学第一医院 急诊科,吉林 长春130021;3.吉林大学第一医院普外科,吉林 长春130021)

胃癌是死亡率较高的消化道恶性肿瘤,易复发,5年存活率偏低,因此对胃癌的早期诊断与治疗一直是国内医学领域研究的重点内容,早期诊断是提高5年存活率的关键。研究发现端粒酶(Telomerase)活性的检测对胃癌是非常有价值的观测指标,有利于胃癌的早期诊断;血清癌胚抗原(carcino-embryonic antigen CEA)及癌抗原125(carbohydrate antigen125,CA125)检测对胃癌诊断有辅助作用。本文通过对44例胃癌标本中的端粒酶活性及其血清癌胚抗原及癌抗原125的检测,探讨它们在胃癌诊断中的临床意义。

1 材料和方法

1.1临床资料

1.1.1病例来源 胃癌病人为治疗组,取胃肠外科2009年手术治疗的胃癌病人44例,男26例,女18例,年龄(18-68)岁,平均59岁。对照组为门诊胃镜取胃良性息肉的病人44例,年龄与治疗组相当。标本均于-80℃冰箱中保存备端粒酶活性检测。两组均抽血检测血清CEA及CA125。

1.1.2病理分期 分期依照UICC1997年标准,44例胃癌患者中:Ⅰ期6例,Ⅱ24期例,Ⅲ期以上14例。

1.1.3病理类型 病理分型依照WHO标准。所选取的病人由我院病理科以常规细胞学诊断方法做出。44例胃癌患者病理类型:高分化18例,中分化16例,未分化10例;胃息肉均为良性。

1.2实验方法

端粒酶提取 取活检组织约50 mg于Ep管中用PBS缓冲液洗净血污,匀浆,加入适量冷PBS于4℃静置片刻,取上清液200 μ L,离心收集细胞,立即加裂解液 25 μ L,混 匀,冰浴 30 min,再于 4℃以15 000 r/min离心10 min,取上清液保存于-20℃以备检测端粒酶活性。

端粒酶活性检测 采用PCR-TRAP法检测端粒酶活性,其反应混合液中含 20 μ L Tris-HCL(pH 8.3),1 mmol/L MgCl2,63 mmol/L KCl,0.005%Tween 20,1 mmol/L EGTA,50 mmol/LdNTP,1 μ g T4 基因 32蛋白 ,BSA 0.1 μ g/mL,α-32p-dCTP 7.4 kBq,Taq DNA聚合酶 2 IU,TS 引物 0.1 μ g 和蛋白提取物 6 μ g,加高压去离子水,至终体积25 μ L。混匀后,上层覆盖石蜡油,于37℃保温 30 min。90℃2 min灭活端粒酶,加CX引物0.01 μ g在 PCR 扩增仪上扩增,扩增条件:94℃变性2 min,95℃40 s,50℃40 s,72℃50 s,共31循环;72℃延伸5 min。取PCR 产物 10 μ L,在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,X线胶片放射自显影,-80℃24-48 h显示结果,出现6 bp梯形带时结果为阳性,每次检测以6 μ g Hela细胞蛋白做阳性对照。

1.3血清癌胚抗原及癌抗原125检测

血清CEA及CA125入院后由检验科常规检测,CEA超过20 ng/ml时往往提示消化道肿瘤阳性;CA125超过35 U/ml往往提示肿瘤阳性。

1.4统计学方法采用SAS 9.0软件进行统计分析,组间比较使用 χ2检验。

2 结果

2.1端粒酶、血清CEA、血清CA125在胃癌及胃息肉组织中的表达胃癌组织的端粒酶、血清CEA、血清CA125阳性表达与胃息肉组织比较差异均有统计学意义(均P＜0.01)。胃癌组织端粒酶阳性率高于CEA、CA125阳性率,差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2端粒酶、血清CEA、血清CA125在胃癌组织中不同分化程度、不同分期的阳性表达情况见表2。

表1 胃息肉良性和胃癌患者端粒酶、CEA、CA125阳性率比较[n(%)]

表2 胃癌患者端粒酶、CEA、CA125不同分化程度、不同分期的阳性率比较[n(%)]

胃癌患者端粒酶、CEA、CA125在不同分化程度差异均无统计学意义,P＞0.05.CEA、CA125在Ⅲ期-Ⅳ期与Ⅰ期比较差异有统计学意义均P＜0.05.

2.3端粒酶、血清CEA、血清CA125在胃癌组织的联合表达

端粒酶、血清CEA、血清CA125在胃癌组织表达呈正相关(P＜0.05)。44例胃癌中共有22例端粒酶、血清CEA、血清CA12同时呈阳性表达,分期晚的病例同时阳性率较高。

3 讨论

端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构,由重复DNA序列及相关蛋白质组成。端粒DNA是由5′TTAGGG3′序列片段重复构成,重复次数高达2000次左右。人端粒的重要功能是保持染色体的完整性,防止染色体DNA降解、末端融合、缺失和非常规重组。端粒长度随着有丝分裂的进行而逐渐缩短,当端粒缩短到一定程度,不能维护染色体的稳定时,则导致细胞凋亡及衰亡[1]。端粒酶的激活可维持端粒RNA的稳定,进而促进肿瘤的发生。

端粒酶是一种核糖核蛋白酶,能延长端粒末端的特异性逆转录酶,以自身RNA为模板,反转录合成端粒DNA重复序列,对细胞增殖、衰老和癌变起重要作用[2]。它是一种由端粒酶RNA(hTR)、端粒酶反转录酶(hTERT)和端粒酶相关蛋白1(hTERP1)组成。端粒酶在各类原发肿瘤中的特异性高表达,恶性肿瘤细胞中的端粒酶检出率高达84%-95%,而良性肿瘤和正常组织中端粒酶检出率仅为4%左右[3]。因而为胃癌的早期诊断提供新的思维。

Yagihashi研究结果表明[4]:端粒酶在胃癌的表达高于肠化生及萎缩性胃炎。Maruyama分析了胃癌、胃腺癌、肠化生时,端粒的长度与端粒酶活性间的关系[5],发现在肠化生及腺瘤组织中的端粒缩短及端粒酶活性增高。胃癌时端粒则延长,端粒酶活性更高,Ahn检测胃癌患者端粒酶活性及与DNA聚合酶,K-ras基因点突变的关系[6],认为端粒酶在胃癌的发生、发展中起到钥匙的作用。研究表明端粒酶的异常激活与肿瘤的发生发展有重要关系。此酶在恶性肿瘤中具有活性,而在正常组织或良性肿瘤中失。端粒酶的检测,有望在临床诊断及鉴别诊断中发挥作用。并作为病理及细胞学检查假阴性者一种有价值的诊断方法。

端粒重复扩增法(TRAP)是检测端粒酶催化引物延伸反应的产物作PCR模板,通过寡核苷酸引导DNA连续循环合成和链的分离,使端粒酶反应产物呈指数式扩增。

CA125是一种相对分子质量为200 kD的糖蛋白,起源于胎儿体腔上皮组织,在血清中CA125以群体形式存在,普遍分布于胸膜、心包、腹膜、子宫内膜、生殖道和羊膜等间皮组织细胞表面。当这些部位发生恶性变或受到炎症刺激时,血清中CA125的水平将显著升高。卵巢癌病人组CA125阳性率高达74.30%,在肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌均有一定比例的升高(阳性率为21.60%-50.75%),由于其具有的高灵敏性和低特异性,在许多良性和恶性病变中均显示水平升高[7],本研究中良性息肉阳性率9.1%,胃癌中阳性率54.4%。故不能单独应用,完全不能用做普查筛选。

大肠癌组织可产生一种糖蛋白,作为抗原引起患者的免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原(CEA),可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌,也存在于正常胚胎的消化管组织中,在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物,它能向人们反映出多种肿瘤的存在,对大肠癌、胃癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测估计是一个较好的肿瘤标志物,但其特异性不强,灵敏度不高,对肿瘤早期诊断作用不明显。

本研究中早期胃癌CEA、CA125阳性率33.3%,提示此两种肿瘤标志物对早期胃癌诊断灵敏度低,Ⅲ期-Ⅳ期胃癌阳性率分别为78.9%、71.4%.对进展期胃癌诊断较好。端粒酶、血清CEA、血清CA125呈正相关,提示联合检测端粒酶、血清CEA、血清CA125对胃癌的诊断有一定价值,对判断胃癌的发展程度有指导意义。本研究发现端粒酶活性检测在胃癌早期至晚期阳性率均不低于66.7%,一般高达83.3%以上。可见端粒酶活性的检测对胃癌是非常有价值的观测指标,有利于胃癌的早期诊断,可能成为胃癌新的分子标志物。

[1]Artandi SE,Chang S,Lee SL,et al.Telomere dysfunction promotes nonreciprocal translocations and epithelial cancer inmice[J].Nature,2000,406(6796):461.

[2]Beatty GL,Vonderheide RH.Telomerase as a universal tumor antigen for cancer vaccines[J].Expert Rev Vaccines,2008,7(7):881.

[3]Lundblad V,Wright WE.Telomeres and telomerase:A simple picture becomes complex[J].Cell,1996,87(1):369.

[4]Yagihash iA,Kamesh ima H,Yajima T,et al.The sig nificance of telomerase activity in patients with gastriccancer[J].R insho Byori,1998,46(1):5.

[5]Maruyama Y,Hanai H,Fujita M,et al.Telomere length and telomerase activity icarcinogenesis of the stomch1[J].Jpn J Clin Oncol,1997,27(4):216.

[6]AhnMJ,Noh YH,L ee YS,et al.Telomere length and telomerase active and its clinicopathological singnificance in gastric cancer1[J].Eur J Cancer,1997,3(8):1309.

[7]Sevinc A,Camci C,TurkHM,et al.How to interpret serum CA 125 levels in patients with serosal involvement?A clinical dilemma[J].Oncology,2003,65(1):16.