原发性胆汁性肝硬化患者抗gp210抗体与核膜型抗核抗体的检测及其临床意义

姜慧英,刘 妍

(1.北京京煤集团医院,北京102300;2.北京佑安医院,北京100069)

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一种慢性渐进性胆汁淤积性肝脏疾病,组织学是以破坏小胆管为其特征的非化脓性炎症,并以血清中出现特征性自身抗体为其主要标志。抗线粒体抗体(AMA)是PBC高敏感性血清学指标[1],ANA也在部分PBC患者中出现,在核膜型ANA的患者中发现三种自身抗体,即核心蛋白gp210抗体、核心蛋白p62抗体及核纤层蛋白B受体抗体[2]。本研究小组总结了抗gp210抗体与核膜型抗核抗体在PBC患者中的意义。

1 材料与方法

1.1实验对象以北京佑安医院1999-2006年期间收治确诊的100例PBC患者作为研究对象。诊断标准:采用2000年美国肝病学会PBC指导建议[3]。60例AIH患者、50例 HBV患者和50例HCV患者作为疾病对照组,血库随机抽取50例献血员作为正常对照。AIH采用1999年国际AIH小组制定的诊断标准[4]结合评分系统,病毒性肝炎按照2000年“病毒性肝炎防治方案”诊断[5]。

1.2方法(1)间接免疫荧光法检测自身抗体(ANA、AMA、SMA、LKM、SLA/LP、LC-1):主要步骤为选择 HEP-2细胞和5种组织的冰冻切片作为抗原,采用生物薄片技术将6种切片组合成一个反应区。待检血清自1∶100起稀释,与组织细胞孵育30分钟;加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗体结合30分钟;洗片、封片后荧光显微镜观察结果。组织细胞内出现特异性绿色荧光、血清稀释度＞1∶100为阳性。予以检测抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)、抗平滑肌抗体(SMA)和抗肝肾微粒体抗体(LKM)等自身抗体。(2)免疫印记法(EUROLINE)检测gp210抗体:将膜条放入温育槽中,每槽加1.5 ml标本缓冲液,在摇床温育5 min,倒掉槽内液体。血清1∶100稀释后加入温育槽中在摇床温育30 min后倒掉槽内液体,在摇床上用1.5 ml洗液清洗膜条3次,每次5 min。在槽中加入1.5 ml已稀释酶结合物,在摇床上温育30 min,倒掉槽内液体。洗液清洗膜条。槽中加入1.5 ml底物,在摇床温育10 min,用蒸馏水清洗。将膜条置于结果判定模板中用免疫印记扫描仪读取。所有试剂均采用德国EUROIMMUN实验免疫试剂盒。

1.3统计学处理统计软件采用SPSS软件,计数资料采用行×列χ2检验,计量资料采用独立样本 t检验。

2 结果

2.1100例PBC患者自身抗体特点ANA阳性60例(60%),滴度从 1∶100-1∶3 200不等:其中核膜型 35 例,核点型13例,着丝点型10例,核点合并核膜型2例。AMA阳性100例。3例SMA阳性。gp210阳性33例,gp210阴性67例。

2.2gp210阳性组与阴性组ANA滴度及核型比较(1)gp210阳性组与阴性组ANA滴度比较:gp210阳性组:ANA阳性33例(1∶100-1∶3 200不等),AMA均阳性;gp210阴性组:ANA阳性27例(1∶100-1∶3 200不等),ANA阴性40例,27例中1例SMA阳性。阳性组与阴性组ANA滴度比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。(2)gp210阳性组与阴性组ANA核型比较:gp210阳性组ANA核型分析:30例(90.9%)表现核膜型,2例核膜合并核点型,1例着丝点型。gp210阴性组ANA核型分析:核点型13例(19.4%),9例着丝点型(13.4%),5例核膜型。见表2。

表1 gp210阳性组与阴性组ANA滴度比较(例,%)

表2 gp210阳性组与阴性组ANA核型比较(例,%)

2.3PBC、AIH、HBV、HCV、BD各组gp210阳性数及阳性率

100例PBC患者中,gp210阳性率为33%,明显高于AIH患者的阳性率(13%),而HBV、HCV、BD各组gp210阳性率均为0。(见表3)

表3 PBC、AIH、HBV、HCV、BD各组gp210阳性数及阳性率比较

2.4PBC、AIH、HBV、HCV、BD各组ANA阳性数及核膜型ANA例数比较(见表4)

表4 PBC、AIH、HBV、HCV、BD各组 ANA阳性数及核膜型ANA例数比较

2.5gp210阳性组与阴性组生化指标比较(1)gp210阳性患者与阴性患者一般资料比较:33例gp210阳性患者与67例gp210阴性患者,两组男性与女性比例分别为5∶11和20∶64,两组均以女性发病为主。gp210阳性患者组发病年龄33-70(56.9±10.62)岁,gp210阴性患者组发病年龄34-84(54.24±12.45)岁,两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。gp210阳性组与阴性组患者,两组患者发病年龄分布比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。(2)gp210阳性患者与阴性患者生化指标比较:gp210阳性患者与阴性患者 ALT、AST、Tbil、GGT、ALP、IgG、IgA、IgM 水平差异均无统计学意义(P＞0.05),见表5。(3)gp210阳性患者与阴性患者肝硬化发生率比较:gp210阳性患者肝硬化发生率(28/33例,84.8%)明显高于阴性患者(33/67例,49.3%)(P＜0.01)。

表5 gp210阳性患者与阴性患者生化指标比较(s)

表5 gp210阳性患者与阴性患者生化指标比较(s)

组别 例数 ALT(U/L)AST(U/L)Tbil(umol/l)GGT(U/L)ALP(U/L)IgG(g/l)IgA(g/l)IgM(g/l)阳性 33 61.9±10.2 70.8±43.5 5.57±8.9 181±105 245±115.5 20.4±10.5 3.98±1.8853.56±2.440阴性 67 154±130 145.8±136.84.82±6.8 265±301 244±192.9 16.9±6.34 3.49±1.6774.32±2.604 P值 0.087 3 0.131 2 0.391 2 0.193 0.195 0.098 9 0.127 0 0.187

3 讨论

近年来,随着自身抗体检测水平的不断提高,我国PBC的发病率呈上升趋势,因此对PBC的早期发现和临床诊断显得尤为重要。AMA、M2是目前公认的诊断PBC重要的血清学指标,部分PBC患者会出现高滴度ANA,PBC患者ANA滴度及其核型是否对PBC的诊断有意义成为我们研究的焦点。由于AMA-M2指标对PBC的诊断存在一定的局限性,少部分PBC患者AMA阴性,因此本课题小组用免疫印记法检测了100例PBC患者的自身抗体,其中包括Ko、Ro-52、SLA/LP、LC-1、LKM-1、gp210、PML、Sp100、3E(BPO)等多种自身抗体,现选择抗gp210抗体进行了分析。

本研究在100例PBC患者中检测到33例gp210阳性,疾病对照组60例AIH患者中8例gp210阳性,对这8例患者的临床资料重新评价后发现其中4例为PBC/AIH重叠综合征,另4例是否是AMA阴性的PBC患者有待追踪,而HBV、HCV、BD组gp210均阴性,因此可以推断抗gp210抗体是PBC特异性自身抗体,和国内[6]、国外[7]的研究结论相符。

象其他自身免疫性疾病一样,部分PBC患者除出现AMA外也可出现ANA,利用间接免疫荧光法,ANA可出现多种荧光模式:核点型、核膜型、均质型、着丝点型、核仁型等。本研究提示gp210阳性组与阴性组ANA滴度比较差异无统计学意义,但gp210阳性组与阴性组ANA核型比较有明显差异:gp210阳性组主要表现核膜型(90.9%),其次 2/33(6.1%)表现核膜合并核点型,1/33表现着丝点型;而gp210阴性组19.4%表现核点型,13.4%表现着丝点型,7.5%表现核膜型。推断核膜型ANA是PBC特异性核型。

表现为核膜型荧光染色型的抗核包膜蛋白抗体包括抗gp210、p62、抗核板层B受体抗体等。抗gp210抗体的靶抗原为位于核孔复合物上的210kD跨膜糖蛋白,所识别的表位是gp210羧基末端上的15个氨基酸残基。从表4结果来看,100例PBC患者中60例出现ANA,并且30例(50%)为核膜型ANA,而60例AIH患者中尽管ANA出现的比例高,但是核膜型ANA只有4例,这4例重新评价临床资料后为AIH/PBC重叠综合症,HBV、HCV、BD组没有ANA的出现,说明核膜型ANA是PBC特异性自身抗体核型。Luettig等研究者[7]对因PBC而进行肝移植手术患者的随访中,发现患者在移植术后尽管ANA的滴度明显下降,但是血清中ANA却持续存在而且ANA的免疫荧光反应模式也未改变。进一步提示核膜型ANA是特异性自身抗体,在病变靶器官去除的情况下该抗体仍然存在。

抗gp210抗体不仅可与抗线粒体抗体同时出现,文献报道抗gp210抗体也存在于20%-47%AMA阴性的PBC患者中[8],对于临床、生化和组织学表现疑似PBC而AMA阴性的患者,或AMA阳性而临床症状不典型、存在重叠综合征(如与干燥综合征重叠)的患者,抗gp210抗体检测有重要价值。另外gp210阳性患者肝硬化发生率明显高于阴性患者(P＜0.01),因此该抗体阳性提示患者预后不良,抗gp210抗体可作为PBC患者的预后指标。所以测定gp210抗体并结合ANA荧光模式可以提高PBC的诊断率。我们收集的PBC患者AMA均阳性,因此我们有待增加这部分病例资料。

随着检测手段的提高,越来越多新的自身抗体被发现,自身抗体的联合检测将使更多的PBC患者得到早期诊断和正确治疗。

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