白姑鱼鱼糜的化学组成及冻藏稳定性的研究

安利华，周小敏，方旭波，陈小娥

（1.浙江兴业集团有限公司，浙江舟山 316101；2.浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山 316000）

国内外用于制作鱼糜的原料品种有几十种，一般选用白色肉鱼类，如狭鳕、海鳗等优质鱼类作原料，生产的鱼糜制品弹性和色泽较好。但是，随着近年来传统加工鱼糜的鱼种资源的衰退，在实际生产中，国内众多生产厂家从经济角度考虑，选用资源丰富、价格低廉、不受季节限制的冷冻小规格白姑鱼、带鱼、红娘鱼等低值鱼作为替代品以解决传统优质鱼糜加工原料严重枯竭的难题。但是，这类低值鱼的凝胶特性较差，在冻藏过程中容易发生冷冻变性，从而进一步导致其凝胶性能下降，研究其鱼肉蛋白在冻藏中的物理化学变化及防止冷冻变性是鱼糜加工业面临的重要课题。为此，本研究以舟山产的冷冻小规格白姑鱼Argyrosomus argentatus为研究对象，通过研究鱼肉蛋白在不同温度下冻藏时生化特性和功能特性的变化来探讨其冻藏稳定性，揭示其蛋白冷冻变性的规律，为防止白姑鱼鱼肉蛋白冷冻变性方面的研究提供参考。

目前工业中，最常用的抗冷冻剂是蔗糖和山梨醇，通过抗冷冻剂的添加，能有效地防止鱼肉蛋白质的冷冻变性，但由于甜度和热量高，不符合“低甜、低热”的消费趋势。因而，开发低甜度、低热量抗冻剂成为近来鱼糜加工业的重要课题，乳糖醇、聚葡萄糖、麦芽糊精及高度分支和线型寡聚糖的抗冻效果已得到较为广泛的研究[1]。海藻糖是一种稳定的非还原性双糖，在食品和药品中，它可以非常有效地保护生物膜和生物大分子，避免细胞受到干燥、冷冻和渗透压巨变造成的伤害，可用于食品保鲜、食品甜味剂，甜味弱(只有蔗糖的45%)、热值低(只为蔗糖的1/4)，而且化学性质稳定。乳酸钠是一种安全、高效、无甜味、低热值的防腐保鲜剂及水分保持剂。笔者研究了海藻糖、乳酸钠对冷冻小规格白姑鱼鱼糜蛋白的抗冻效果，取得了比较好的实验效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

冷冻白姑鱼（规格：30～50 g/尾），由浙江兴业集团有限公司提供。

1.1.2 试剂

三磷酸腺苷二钠(ATP)、5,5-二硫代双(二硝基苯甲酸)购于上海生物化工有限公司，1-苯奈氨-8磺酸(ANS)购于Sigma公司，牛血清蛋白购于上海博奥生物科技有限公司，海藻糖(纯度98%)购于广西南宁中诺生物工程有限责任公司，乳酸钠(浓度75%)购于青岛丰泰化工有限公司，液体山梨糖醇(食品级)购于广州合诚化学有限公司，马来酸、钼氨酸、甘油、高氯酸、硼酸、蔗糖等均为国产分析纯或生化级试剂。

1.1.3 主要仪器与设备

日立CR21G II高速冷冻离心机、TM-1000台式扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）、TQ-5型斩拌机（广东恒联食品机械厂）；SD-700鱼糜弹性仪（日本RHEOTEX公司）；半微量凯氏蒸馏装置、索氏脂肪抽提器等。

1.2 方法

1.2.1 白姑鱼肌肉及鱼糜一般化学成分的测定[2]

水分（直接干燥法测定）、灰分（高温炉550℃灼烧法测定）、粗蛋白（微量凯氏定氮法测定）、粗脂肪（索氏脂肪抽提法测定）。

1.2.2 鲜度指标的测定

VBN：康微氏皿法；K 值：HPLC 测定[3]；pH：pH 计测定。

1.2.3 鱼肌肉各种蛋白成分的分离及测定

称取5 g鱼肉或鱼糜，加入50 mL磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH 7.5)，均质2 min，9 000 r/min，4℃离心10 min，沉淀加入50 mL磷酸盐缓冲液重复以上操作，合并2次上清液，加入15%三氯乙酸溶液使其终浓度为5%，9 000 r/min，4℃离心10 min，得上清液A(非蛋白氮)和沉淀B(肌浆蛋白)。以上操作所得沉淀加入10倍磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH 7.5，含有0.45 mol/L KC1)，均质，9 000 r/min 4℃ 离心15 min，重复上述操作1次，合并上清液(肌原纤维蛋白)和沉淀。在沉淀中加入5倍0.1 mol/L NaOH溶液，4℃搅拌提取12 h，9 000 r/min 4℃离心15 min得上清液D(碱溶性蛋白)和沉淀E(基质蛋白)，以上各组分分离出来后，采用凯式定氮法测定蛋白含量。

1.2.4 肌原纤维蛋白的提取

鱼肉中加入5倍(W:V)0.05 mol/L KC1-20 mmol/L Tris-maleate缓冲液(pH 7.0)混匀，9 000 r/min 4℃离心10 min，弃去上清液，重复洗涤1次。沉淀加入3倍(W:V)0.6 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-maleate缓冲液，10 000 r/min匀浆90 s。尼龙滤网过滤结缔组织，静置30 min以充分溶解蛋白，9 000 r/min 4℃离心20 min。收集上清液，使用10倍体积蒸馏水稀释溶液使肌原纤维蛋白沉淀，弃除上层清液，析出蛋白于9 000 r/min，4℃离心5 min，沉淀由同体积0.6 mol/L KCl溶解。

1.2.5 肌原纤维蛋白Ca-ATPase活性测定

Ca-ATPase活性的测定提取肌动球蛋白参考文献[4]的方法，Ca-ATPase活性以每毫克蛋白质在每分钟内生成的无机磷(Pi)的量μmol(Pi)/（mg·min）表示，采用钼酸氨法测定反应中释放的无机磷(Pi)含量[5]。

1.2.6 鱼糜及鱼糜凝胶的制备

（1）鱼糜生产工艺流程

原料鱼(冷冻白姑鱼)处理→清洗→采肉→淡碱水（0.5%NaHCO3溶液，1：4）漂洗3次→旋转筛初次脱水→螺旋压榨脱水→精过滤→成型机成型→平板机速冻→冻藏。

（2）鱼糜蛋白凝胶的制备

将冻藏的冷冻鱼糜1 000 g，半解冻后用斩拌机在10℃以下空擂5 min，添加质量分数为3.0%的食盐继续盐擂30 min，整个过程保证温度在10℃以下，真空脱气。将鱼糜填充至直径为30 mm的尼龙肠衣中，两端结扎，采用两段加热法(40℃加热30 min后90℃加热30 min)制备鱼糜凝胶。加热后迅速将鱼肠置于冰水中冷却10 min，然后置于4℃过夜后用于凝胶强度的测量。

1.2.7 凝胶强度的测定

将制备好的鱼肠取出，在室温条件下放置3 h，再剥去薄膜后，切成长度25 cm的小段。将小段放在弹力测试机的测试平台上，用直径为5 mm的球形测试头压入其端面中心，测试头的推进速度为60 mm/min，试样破裂时读取推进的强度和凹陷值。用同样方法测试5块，取其平均值。凝胶强度=破断强度×凹陷程度，单位为 g·cm。

1.2.8 扫描电镜观察

鱼糜样品切为5 mm的立方体，浸入包埋剂(OCT)中，分别冻藏于3种温度条件下。冻藏结束后取出，将鱼糜凝胶样品用质量分数为2.5%戊二醛溶液4℃下固定24 h，再用浓度0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗3次。然后用质量分数为1%的锇酸溶液固定2 h，再用浓度为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)漂洗3次。依次用不同浓度梯度（包括50%、70%、80%、90%、95%五个浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，最后用醋酸异戊酯脱乙醇，用二氧化碳临界点干燥仪进行干燥，真空离子溅射镀白金膜。将处理好的样品在TM-1000台式环境电子显微镜中观察，加速电压为20 kV。

1.2.9 不同抗冻剂鱼糜样品的制备

将漂洗样品分成4份，1份不添加任何抗冻剂，作为对照样鱼糜，另3份分别添加8%海藻糖、8%乳酸钠及8%商业抗冻剂，搅拌均匀于-20℃冻藏，定期取样测定各项指标。

2 结果与讨论

2.1 白姑鱼肌肉与鱼糜的化学成分及鲜度指标

白姑鱼肌肉与鱼糜的化学成分及鲜度指标见表1。由表1可知，在白姑鱼鱼肉中，以干重计算，蛋白质含量为81.70%，而且色素蛋白含量低，能够满足鱼糜的加工要求；其脂肪含量较高9.75%，因此在鱼糜加工中应考虑脱脂。原料鱼K值为11.34%，而K值低于20%的鱼属于新鲜度比较高的鱼，原料的pH为6.37，说明原料处于pH下降阶段，是较为新鲜的[6]；但由于鱼糜最佳凝胶pH在6.5～7.5之间，所以应采用碱漂洗提高原料的pH，且碱漂洗可部分脱脂。TVBN值为145.7 μg/g，低于200 μg/g，进一步证明了原料的新鲜程度。白姑鱼加工成鱼糜后，蛋白含量提高8.02%，灰分和脂肪含量分别比鱼肉降低了72.91%和57.74%，说明漂洗过程中去除了鱼肉中大部分脂肪和盐类。此外，pH得到一定程度的提高，有利于鱼糜凝胶的形成。

2.2 白姑鱼鱼肉及鱼糜蛋白组成

白姑鱼鱼肉及鱼糜蛋白中各种蛋白组分的含量见表2。由表2可知，各组分蛋白含量之间差异明显，其中含量最高的是肌原纤维蛋白，达到51.3%，其次是碱溶性蛋白、肌浆蛋白、非蛋白氮和基质蛋白。白姑鱼的鱼肉在加工成鱼糜以后，由于经过漂洗工序，蛋白组分比率发生了变化，肌原纤维蛋白的含量相对升高，比鱼肉中增加了16.9%。而非蛋白氮和肌浆蛋白含量大大降低，分别降低了52.0%和55.45%，由此可见，漂洗工序很大程度上去除了白姑鱼鱼肉中的非蛋白氮和水溶性蛋白。一般来说，水溶性蛋白对鱼糜凝胶的形成并无贡献，而且与肌原纤维蛋白一起加热时，会影响肌原纤维蛋白的充分溶出和形成凝胶网状结构。小白姑鱼中水溶性蛋白比例较低，因此在制备鱼糜时有利于提高产率和鱼糜制品质量。

2.3 白姑鱼肌原纤维蛋白在冻藏过程中Ca-ATPase活性变化

白姑鱼鱼肉在-10℃、-20℃和-30℃冻藏过程中肌原纤维蛋白Ca-ATPase活性的变化情况如图1。从图1可以看出，随着冻藏时间的延长，3个温度下冻藏的鱼肉蛋白Ca-ATPase活性均呈下降趋势。在冻藏开始4周内，所有样品的Ca-ATPase活性下降都比较明显。之后-30℃冻藏的鱼肉蛋白Ca-ATPase活性下降不明显，-20℃冻藏的鱼肉蛋白在4～6周过程中仍下降比较显著，6～12周下降程度较小，而-10℃冻藏的鱼肉蛋白在冻藏过程中一直有比较显著的降低，冻藏结束时活性几乎丧失。在12周后，-30℃、-20℃和-10℃冻藏鱼肉的肌原纤维蛋白Ca-ATPase活性分别从冻藏前的0.391 μmol(Pi)/（mg·min）下降到0.231 μmol(Pi)/（mg·min），0.151 μmol(Pi)/（mg·min）和0.081 μmol(Pi)/（mg·min），依次下降了40.9%、61.4%和79.3%。

ATPase位于肌球蛋白头部，当肌球蛋白在冻藏过程中发生变性时，则ATPase活性受到严重影响，失去活性，故测定ATPase的活性能较好地反映肌球蛋白的变性情况[7]。鱼肉在冻藏过程中，蛋白中氢键、疏水键、二硫键和离子键的改变会导致蛋白结构的变化，使蛋白固有的酶活性降低，降低程度与鱼种有关。图1结果表明，小规格的白姑鱼鱼肉抗冻性弱，鱼肉蛋白在冻藏过程中容易发生变性，冻藏时间越长，变性程度越大；同时，蛋白的变性程度和冻藏温度有关，在-30℃、-20℃和-10℃冻藏时，变性程度差异显著，冻藏温度越低变性速度越慢。

2.4 白姑鱼鱼糜在冻藏过程中凝胶特性变化

从不同冻藏温度下鱼糜凝胶强度变化趋势图(图2)中可知，随着冻藏时间的延长，凝胶强度呈明显下降趋势。鱼糜在-10℃冻藏时，凝胶强度下降最快，冻藏12周后，凝胶强度由冻藏前的183.1 g·cm降低到107.1 g·cm，下降了41.5%。而鱼糜在-20℃和-30℃冻藏条件下凝胶强度下降缓慢，-30℃冻藏12周后，凝胶强度仍达158.2 g·cm，为鱼糜原样的86.4%。

表1 白姑鱼鱼肉及鱼糜的化学成分(g/100 g)及鲜度指标Tab.1 Chemical composition(g/100 g)and freshness index of surimi and fish meat

表2 白姑鱼鱼肉及鱼糜的蛋白质组分(g/100 g)Tab.2 Protein compositions(g/100 g)of Argyrosomus argentatus surimi and fish meat

图1 白姑鱼肌原纤维蛋白Ca-ATPase活性在冻藏过程中的变化Fig.1 The Ca-ATPase activity changes of Argyrosomus argentatus during frozen-storage

图2 白姑鱼鱼糜凝胶强度在冻藏过程中的变化Fig.2 The gel strengthen changes of Argyrosomus argentatus surimi during frozen-storage

2.5 白姑鱼鱼糜冻藏后微观结构变化

实验对-30℃、-20℃和-10℃冻藏14周后的鱼糜样品进行电镜观察，照片如图3所示。从图3可以看出，鱼糜在-10℃冻藏后，鱼糜微结构杂乱，组织间空隙明显，结晶水比例较大，说明冰晶颗粒较大；-20℃冻藏时，鱼糜结构显示出一定的规律，冰晶颗粒较小；-30℃冻藏后，鱼糜结构致密，冰晶排列呈规律分布，颗粒很小，对蛋白质的立体结构破坏较小。这些结果说明，鱼糜在不同温度冻藏时，鱼糜中蛋白质变性的速度和程度不同，在较高温度下冻藏，蛋白变性速度快，其主要原因是鱼糜中有更多的结合水形成冰晶，冰晶颗粒的增长加速了蛋白变性。

2.6 不同抗冻剂对冻藏白姑鱼鱼糜蛋白凝胶强度的影响

图3 不同温度冻藏条件下鱼糜微结构观察Fig.3 The ultra-structures of of Argyrosomus argentatus surimi during frozen-storage at

白姑鱼鱼肉在冻藏过程中容易发生冷冻变性，导致鱼糜凝胶劣化，因此，开发优质冷冻白姑鱼鱼糜，必须找到有效的抗冻剂来抑制蛋白的冷冻变性。实验对海藻糖、乳酸钠对白姑鱼鱼糜蛋白的抗冻效果进行了研究，并与传统的“商业抗冻剂”（蔗糖/山梨糖醇）进行比较，结果见图4。

图4表明，对照样白姑鱼鱼糜的凝胶强度随着冻藏时间的增加明显下降，其中，第1周下降最显著，约下降了9.0%；添加抗冻剂后，凝胶强度下降趋势要缓慢得多。冻藏12周后，对照样凝胶强度只有139.2 g·cm，下降了24.0%；而添加海藻糖、乳酸钠和蔗糖/山梨糖醇后，凝胶强度分别为 163.1 g·cm、156.4 g·cm 和161.5 g·cm，海藻糖和乳酸钠样品差别不明显，与商业抗冻剂样品相当，凝胶强度的下降程度依次为10.9%、14.6%和11.8%，均显著低于对照样。以上结果说明，白姑鱼鱼糜蛋白在冻藏过程中易发生变性，凝胶能力下降，而3种抗冻剂具有较好的抗冻效果，可显著抑制其凝胶能力的降低。其中海藻糖和乳酸钠的抗冻效果与商业抗冻剂相当。

2.7 不同抗冻剂对冻藏白姑鱼鱼糜蛋白Ca-ATPase活性的影晌

由图5可知，随着冻藏时间增加，对照样Ca-ATPase活性不断下降，冻藏12周后，其活性只有0.151 μmol(Pi)/（mg·min），下降61.3%；而添加3种抗冻剂的样品的Ca-ATPase活性虽然整体上呈下降趋势，但其下降程度比对照样低。冻藏12周后，其活性分别为0.261 μmol(Pi)/（mg·min）、0.251 μmol(Pi)/（mg·min）和0.248 μmol(Pi)/（mg·min），均明显高于对照样，3种抗冻剂的作用效果相当，以上结果从另外一个角度说明在冻藏过程中，白姑鱼鱼糜的肌球蛋白尤其是肌球蛋白头部发生了严重的变性，添加各种抗冻剂可较好地抑制其冷冻变性，其中海藻糖和乳酸钠的抗冻效果可与商业抗冻剂比拟，可以在工业化生产中单独应用或复配使用。海藻糖和乳酸钠都属于低甜度、低热值物质，因此在鱼糜加工业中有望成为传统商业抗冻剂的替代物。

图4 抗冻剂对白姑鱼鱼糜在-20℃冻藏过程中凝胶强度的影响Fig.4 EffectofcryoprotectantsonArgyrosomusargentatus Surimigelstrengthenduringfrozen-storageat-20℃

图5 抗冻剂对白姑鱼鱼糜在-18℃冻藏过程中肌原纤维蛋白Ca-ATPase活性的影响Fig.5 Effect of cryoprotectants on the Ca-ATPase activity Argyrosomus argentatus surimi during frozen-storage at-18℃

3 结论

白姑鱼鱼肉蛋白质含量高，且色素蛋白含量低，能够满足鱼糜的加工要求；加工成鱼糜后，蛋白含量提高了8.02%，灰分和脂肪含量分别比鱼肉降低了72.91%和57.74%，说明漂洗过程中去除了鱼肉中大部分脂肪和盐类。

白姑鱼肌肉各组分蛋白含量之间差异明显，含量最高的是肌原纤维蛋白，其次是碱溶性蛋白、肌浆蛋白、非蛋白氮和基质蛋白；加工成鱼糜以后，由于经过漂洗工序，蛋白组分比率发生了变化，肌原纤维蛋白的含量相对升高，而非蛋白氮和肌浆蛋白含量大大降低。

在-30℃、-20℃和-10℃不同温度下冻藏时，肌原纤维蛋白都容易发生变性，并且冻藏温度越高变性速度越快，而凝胶强度则随着冻藏时间的延长呈明显下降趋势。鱼糜微观结构显微镜照片显示，鱼糜在-10℃冻藏16周后，鱼糜凝胶结构杂乱，组织间空隙明显，冰晶颗粒较大。-20℃冻藏时，鱼糜结构显示出一定的规律，冰晶颗粒较小；-30℃冻藏后，鱼糜结构致密，冰晶排列呈规律分布，颗粒很小，说明鱼糜冻藏过程中，冰晶的形成和增长可能造成了鱼肉蛋白的变性。

冻藏过程中，研究了海藻糖、乳酸钠对白姑鱼鱼糜蛋白的抗冻效果，结果表明抗冻效果可与商业抗冻剂比拟，可以在工业化生产中单独应用或复配使用。

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