生肌中药对组织工程皮肤移植后VEGF表达的影响*

靳俊峰，刘爱军，杜标炎

(1.遵义医学院珠海校区，广东珠海 519041;2.广州中医药大学基础医学院，广东广州 510006)

组织工程皮肤是近年兴起的一门新兴学科，即利用来源于自体或异体的皮肤细胞，与适宜的真皮支架复合，在体外构建而成的皮肤类似物，将其移植入皮肤缺损创面，修复缺损的皮肤。皮肤缺损是临床上的常见病与多发病，组织工程皮肤的问世为解决皮肤移植中的皮源不足问题提供了光明前景。但目前组织工程皮肤移植后存在血管化进程慢等问题，导致移植成功率低[1]，限制了其进一步的应用。

中医学在治疗皮肤创伤方面有着悠久的历史，“生肌法”是其治疗皮肤创伤的一项重要治则，生肌中药通过“收敛止血、活血化瘀、祛腐生肌”等作用促进缺损皮肤的修复[1]。现代研究显示，血管内皮细胞生长因子是最强的促血管再生因子[2]，本研究中我们将构建的组织工程皮肤移植后，利用经典方剂乳没生肌散、“活血圣药”龙血竭，对移植后的组织工程皮肤进行外敷和/或内服治疗，观察创面微环境中VEGF表达的变化，探讨利用中药的生肌作用促进组织工程皮肤移植后血管化进程的可能性。

1 材料与方法

1.1 主要材料

高糖-DMEM及低糖-DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津灏洋生物制品科技有限公司);25cm2塑料培养瓶(Coning公司);胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶(均为Sigma公司);其他试剂均为国产分析纯。乳没生肌散中各种药材均购自广州市杏园春大药房;幼儿包皮取自中山一院儿外科无菌切除标本(病人家属知情);人角质形成细胞购自中山大学北校区实验动物中心;胶原海绵购自广州市创尔生物技术有限公司。

1.2 动物

SPF级裸鼠，雌雄不拘，约20g，购自本校实验动物中心，合格证号 SCXK粤2003-0001，粤监证字2007A015。

1.3 免疫荧光试剂及仪器

Ⅰ抗血管内皮细胞生长因子VEGF(博士得生物试剂公司)，Ⅱ抗红色荧光探针(Cy3)标记的山羊抗小鼠IgG(IgG-Cy3)及核标记物二脒基苯基吲哚(DAPI)(Sigma公司)。日本产IX71奥林巴斯倒置荧光显微镜。

1.4 方法

1.4.1 人皮肤细胞的培养 人角质形成细胞常规传代培养。幼儿包皮成纤维细胞由本实验室分离、培养和鉴定[3]。

1.4.2 组织工程皮肤的构建 将无菌的胶原海绵剪成1cm×1cm×0.2cm小块，放入无菌24孔板内，取3～5代人包皮成纤维细胞，按1×105个/cm2将细胞种植与于胶原海绵两面，体积分数5%CO2、37℃静置培养3h～4h。将人角质形成细胞以1×105个/cm2密度接种于单面胶原海绵，无菌培养3～4h。

1.4.3 组织工程皮肤的移植 SPF级裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/Kg用药)，固定于手术台上，严格消毒后沿背部正中线左右距脊柱约0.5cm处皮肤呈“C”形切开，形成皮瓣，分离皮下组织至深筋膜暴露肌层，切口大小约1cm2。将体外构建的组织工程皮肤覆盖到全层皮肤缺损的创面，再用无菌凡士林纱布覆盖，单针缝线固定皮瓣与正常皮肤上，无菌纱布包扎。术后2d拆除敷料，剪掉皮瓣，单笼饲养。

1.4.4 分组 实验动物随机分为5组，每组4只，分为乳没生肌散外敷组、龙血竭外敷组(隔日换药)、龙血竭内服组、龙血竭外敷并内服组(70mg/kg/d灌胃)，不用药者为空白对照组。术后9d取材检测，单笼避光饲养。

1.4.5 HE染色及免疫荧光检测 术后9d取材，连同周边正常皮肤剪去少许，4℃、40g/L多聚甲醛(pH 7.4)固定6h～8h，300g/L蔗糖过夜，冰冻切片，片厚8μm，部分行苏木素-伊红(HE)染色，部分行VEGF抗体免疫荧光组织化学染色，Ⅰ抗浓度为1∶100，Ⅱ抗 IgG-Cy3浓度 1∶100。封片剂为甘油PBS(甘油∶PBS 为9∶1)。

免疫荧光组织化学染色步骤:冰冻切片，PBS(PBS 0.01M，pH=7.4)洗3遍。体积分数3%正常羊血清封闭，室温30min，注意不用PBS洗。加I抗VEGF，4℃过夜后PBS洗3遍。加Ⅱ抗山羊抗小鼠IgG-Cy3，室温下孵育1h，PBS洗3遍。DAPI复染核15min。甘油PBS封片，荧光显微镜观察并拍片。

2 结果

2.1 移植处大体观察

术后2d各组创面缩小，手术部位无红肿、明显收缩、脓性分泌物等，移植物黏附于创面，表面光滑较硬;术后9d移植处开始变软，呈白色，表面光滑。

2.2 组织学检测结果

正常裸鼠皮肤表皮较薄，表皮细胞深入真皮层中，形成毛囊样、皮脂腺样等皮肤附属器，真皮结缔组织较疏松，胶原纤维少(图1)。组织工程皮肤移植后9d，对照组表皮细胞增生为多层，表皮较厚，部分区域与真皮连接不紧密，真皮较致密，胶原纤维增多，排列紊乱(图2);乳没生肌散治疗组、龙血竭治疗各组标本表皮亦增生较厚，表皮与真皮连接较均匀，真皮较致密，胶原纤维增多，排列方向较均匀一致，可见较多新生毛细血管(图3、4)，尤以龙血竭外敷并内服组明显(图4);对照组及各实验组标本均未见毛囊样、皮脂腺样等皮肤附属器。

图1 正常裸鼠皮肤，表皮较薄，真皮结缔组织疏松，含较多毛囊样、皮脂腺样结构(×200)图2 对照组组织工程皮肤移植处9d，表皮增厚，表皮与真皮连接欠佳，真皮致密，胶原纤维排列紊乱(×200)图3 乳没生肌散组，表皮较厚，表皮与真皮连接紧密，结缔组织致密，胶原纤维排列整齐，毛细血管增生(×200)图4 龙血竭外敷并内服组，表皮与真皮结构同乳没生肌散组，毛细血管增生明显(×200)

2.3 免疫荧光检测结果

组织工程皮肤移植后9d，对照组标本表皮及真皮有少数VEGF表达阳性细胞(图5)，乳没生肌散治疗组及龙血竭治疗各组表皮可见明显的VEGF表达阳性细胞，真皮中亦有VEGF表达阳性细胞，其中龙血竭外敷并内服组VEGF表达阳性细胞多于其他各组(图6～9)。

图5 组织工程皮肤移植后9d，对照组表皮(图5a)和真皮(图5b)中均有少数VEGF阳性细胞(图5A、5B)(×200)

图6 组织工程皮肤移植后9d，乳没生肌散外敷组表皮和真皮(图6a)中VEGF阳性产物(图6A)增多增强(×200)图7 组织工程皮肤移植后9d，龙血竭外敷组表皮和真皮(图7a)中VEGF阳性(图7A)产物增多增强(×200)

图8 组织工程皮肤移植后9d，龙血竭内服组表皮(图8a)和真皮(图8b)中VEGF阳性(图8A、8B)产物增多增强(×200)

图9 组织工程皮肤移植后9d，龙血竭外敷并内服组表皮(图9a)和真皮(图9b)中VEGF阳性(图9A、9B)产物明显增多增强(×200)

3 讨论

组织工程皮肤是修复大面积皮肤缺损的最佳选择，并且在治疗瘢痕挛缩及整形美容等领域都有重要的应用价值[4]。组织工程皮肤移植后血管化进程慢而导致移植成功率低是限制组织工程皮肤进一步应用的一个主要原因[5]。“生肌法”是中医学在医疗实践中形成的重要治则，时至今日仍显示出独特的优势。中医所讲的“肌”包括皮肤、黏膜、肌肉、神经、血管、骨等组织。现代医学认为，皮肤缺损修复主要包括肉芽组织增生、血管长入及上皮组织增生重新覆盖创面等过程，“生肌”就是促进这个过程的完成[6]。

VEGF是目前公认的最强的促血管再生因子，利用生肌中药作用于移植后的组织工程皮肤能否促进VEGF的表达、能否促进毛细血管再生，进而促进皮肤创面的修复是本研究的主要内容。乳没生肌散是中医药治疗皮肤损伤的经典方剂，据《古方汇精》所载，该方剂中含生乳香、生没药、血竭、红升、麝香、冰片等。其中乳香、没药、血竭为重要的活血化瘀药，具有活血行气止痛、活血消痈、去腐生肌的功效，为外伤科要药[7]。研究亦证实，乳没生肌散作用于移植后的组织工程皮肤，在早期能促进VEGF的表达，促进毛细血管的再生。由于乳没生肌散中各种成分复杂，真正的有效成分及确切的作用机制仍未完全明了，所以本研究又再此基础上探讨了被誉为“活血圣药”龙血竭对组织工程皮肤移植后的作用。实验结果显示，龙血竭亦能促进组织工程皮肤移植后VEGF的表达，毛细血管增生明显，以龙血竭外敷并内服治疗组效果最佳。本研究结果强烈提示，生肌中药作用于移植后的组织工程皮肤能增强VEGF的分泌，促进毛细血管再生，有利于促进组织工程皮肤修复皮肤缺损。

[1]易成刚，郭树忠，陈建宗.生肌类中药的理论与实验研究[J]. 中国临床康复，2004，8(29):6470-6471.

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[3]刘爱军，靳俊峰.人皮肤成纤维细胞的高效分离培养及鉴定[J]. 广东医学，2008，29(12):1969-1970.

[4]Hu S，Kirsner RS，Falanga V，et al.Evaluation of Apligraf persistence and basement membrane restoration in donor site wounds:a pilot study[J].Wound Repair Regen，2006，14(4):427-433.

[5]Anthony D.Metcalfe and Mark WJ.Ferguson.Bioengineering skin using mechanisms ofregeneration and repair[J].Biomaterials.2007，28(34):5100-5113.

[6]范吾凤，阎伟，公洁.有关促进创面愈合的外用中药的研究进展[J].中医外治杂志，2003，12(6):36-37.

[7]沈映君主编.中药药理学[M].北京:人民卫生出版社，2000.655-657.