双三口服液对实验COPD大鼠血清白细胞介素-8和肿瘤坏死因子-α的影响*

黄修解，蒙定水，牛豫洁，杨 柯，曾春晖

(1.广西中医学院附属瑞康医院，广西南宁 530011;2.广西中医学院药学院，广西南宁 530001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种具有气流受限特征的疾病。气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。COPD主要累及肺脏，但也可引起全身(或称肺外)的不良效应[1]。据统计，全球 COPD居当前死亡原因的第4位。目前对COPD防治研究已成为医学界研究的热点课题。COPD的发病机制十分复杂，涉及多种因素[2]。近年来，随着对COPD气道炎症的深入研究，普遍认为激活的炎性细胞释放多种介质，包括白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等在COPD的发病中起着重要作用。以笔者为主的研究组前期研究表明，双三口服液对COPD有较好的预防和治疗作用，但其作用机制尚未阐明。本实验参照文献法制作COPD大鼠模型，用放射免疫法检测双三口服液对COPD大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α的含量，进一步探讨其对COPD防治作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 取健康成年雄性普通级Wistar大鼠48只，鼠龄10周，体重160g～180g，由广西中医学院动物实验中心提供(桂医动字11004)。

1.1.2 药物 双三口服液(规格:10ml/支，每支含生药7.5g，由广西中医学院附属瑞康医院制剂室提供，批号20060702)。成人每日用量为30ml～60ml，折合生药量为22.5g～45g。实验动物与成人用药量的换算方法[1]:人用量×0.0026×50=大鼠用量/kg体重。

1.1.3 试剂 IL-8、TNF-α试剂盒购自广州齐云生物技术有限公司;脂多糖购自广州齐云生物技术有限公司(由美国Sigma公司生产)。

1.1.4 主要仪器 AEU-210型电子天平，日本岛津厂;722型分光光度计，上海第二分析仪器厂;80-2型离心机，上海手术器械厂。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作 参照朱慧志[3]法:采用烟雾吸入+脂多糖灌肺复合因素建立COPD大鼠模型。在造模的第1天、第14天将大鼠以适量乙醚吸入麻醉后，暴露喉头，以静脉套管针替代气管导管行气管插管，向大鼠气管内注入脂多糖 LPS 100μl(μg/μl)，完毕后将大鼠直立旋转 10s～20s，使 LPS均匀分布于肺部。第2～13天、第15～28天，每天在有机玻璃密闭箱(80×60×50cm3上方有一直径为1.2cm的通气孔)持续吸入新鲜的香烟雾(南宁卷烟厂生产真龙牌香烟，焦油含量19mg，尼古丁1.2mg)30min，20支/d，每天熏烟后立刻用低于环境温度(20℃)5℃冷空气刺激1h，造模28d结束。

1.2.2 动物分组及给药 将健康普通级同龄(10周龄)雄性Wistar大鼠48只，体重160g～180g，随机分为A、B、C、D 4组，每组12只。A组(空白对照组)大鼠正常饲养，每天灌服等量生理盐水;B、C、D 4组进行COPD造模，B组为模型组，C组为双三口服液干预组，D组为地塞米松对照组。B组(模型组)大鼠在COPD模型的同时，亦正常饲养，每天灌服等量生理盐水;C组大鼠在制备COPD模型的同时，于每天熏香烟前按16ml/kg的剂量灌服双三口服液;D组则给予醋酸地塞米松片4.5mg/kg，给药容量20ml/kg。

1.2.3 标本制作和处理 各组动物造模28d结束后，先将动物称重，腹腔内注入2%戊巴比妥钠(25mg/kg)麻醉，将大鼠仰卧位固定，在股动脉处取血约5ml，放于试管中待血液自然凝固、室温3000r/min离心15min后，取上清液即血清分装于ependorf管置于－20℃冰箱。沿正中线剪开皮肤和腹壁肌肉，剪断两侧肋骨和胸肌，暴露胸腔。立即用生理盐水10ml分3次行左肺支气管肺泡灌洗，回收灌洗液(BALF)，总回收率为60% ～80%，行白细胞计数及分类。同时剥离胸腺和脾脏后，滤纸吸干残血后立即用电子天平称重。指数计算采用以下公式:胸腺指数=(胸腺重量/小鼠体重)×100，脾脏指数=(脾脏重量/小鼠体重)×100。

1.2.4 IL-8、TNF-α的检测 用双抗体夹心ELISA法检测血清中IL-8、TNF-α含量，严格按照检测试剂盒的说明书操作。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 病理学改变

空白组无支气管黏膜下肌层增生、肥厚，无黏膜层、黏膜下层及肌层大量炎性细胞浸润，无肺泡壁破裂及弹力网破坏。模型组支气管肺组织的病理改变基本符合人类COPD的特点。光镜下可见支气管纤毛柱状上皮细胞部分脱落，杯状细胞增生，支气管黏膜下肌层增生、肥厚，黏膜层、黏膜下层及肌层大量炎性细胞浸润;细支气管壁周围可见较多炎性细胞浸润，肺泡壁变薄、肿胀、破裂或形成大泡，弹力网破坏。干预组和对照组与模型组比较，炎性细胞浸润明显减少，杯状细胞增生明显减轻，且肺泡壁无明显破裂。

2.2 肺泡灌洗液(BALF)中白细胞计数及分类

表1显示，空白组与模型组、干预组、对照组中的BALF炎性细胞总数、中性粒细胞数、淋巴细胞数、单核/巨噬细胞数比较，差异有显著性。

表14 组BALF中白细胞计数及分类比较(s)

表14 组BALF中白细胞计数及分类比较(s)

注:与模型组比较:#P<0.01;与对照组比较:*P>0.05

组 别 n 白细胞计数×108/L细胞分类(%)巨噬细胞空白组中性粒细胞 淋巴细胞 单核/12 0.81±0.13 0.11±0.03 0.03±0.01 0.70±0.14模型组 12 8.76±0.61 3.43±0.33 1.67±0.45 4.57±0.52干预组 12 4.21±0.23#* 0.72±0.41#* 0.41±0.23#* 2.51±0.23#*对照组 12 3.97±0.19# 0.63±0.27# 0.36±0.13# 2.31±0.17#

2.3 干预组与模型组、对照组胸腺质量、脾脏质量、胸腺指数及脾脏指数比较(见表2)。

表2 各组胸腺质量、胸腺指数、脾脏质量及脾脏指数比较(s)

表2 各组胸腺质量、胸腺指数、脾脏质量及脾脏指数比较(s)

注:与模型组比较:#P<0.05;与对照组比较:*P>0.05

组 别 n 脾脏质量(g)脾脏指数 胸腺质量(g)胸腺指数空白组12 0.946±0.113 0.543±0.045 0.418±0.062 0.240±0.030模型组12 0.705±0.093 0.403±0.032 0.309±0.053 0.177±0.021干预组12 0.863±0.105 0.496±0.038#*0.421±0.070 0.241±0.027#*对照组12 0.852±0.121 0.432±0.027#0.417±0.062 0.238±0.029#

2.4 各组大鼠血清中IL-8、TNF-α的浓度比较

表3显示，模型组大鼠血清中IL-8、TNF-α较空白组明显升高，差异有显著性(P<0.05)。干预组和对照组大鼠血清中IL-8、TNF-α较模型组比较均明显下降，差异有显著性(P<0.05)。干预组和对照组比较，差异无显著性(P>0.05)，表明双三口服液和地塞米松均可降低COPD大鼠IL-8、TNF-α水平。

表34 组IL-6、IL-8、TNF-α浓度的比较(ng/L，s)

表34 组IL-6、IL-8、TNF-α浓度的比较(ng/L，s)

注:与空白组比较:△P<0.01;与模型组比较:#P<0.01;与对照组比较:*P>0.05

组 别 n IL-8 TNF-α 12 0.423±0.173 10.053±2.311模型组 12 0.873±0.152△ 13.971±2.621△干预组 12 0.612±0.161△#* 12.091±2.038△#*对照组 12 0.593±0.134△# 11.936±2.014△#空白组

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种具有气流受限特征的疾病。气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关。目前国内外研究普遍认为，慢性阻塞性肺疾病(COPD)病理基础是气道壁和肺实质的慢性炎症及结构改变，致气道重塑最终导致气道管腔狭窄和进展性气流阻力增加。细胞因子在COPD发病中起着关键作用，而其中主要的致病因子则是IL-8和TNF-α。

IL-8是第一个被发现的有化学趋向作用的细胞因子，由多种参与炎症反应的细胞产生，如巨噬、中性粒、淋巴和内皮细胞等。大量的研究表明，IL-8在慢性呼吸道炎症中起着关键性作用，它可以激活中性粒细胞多方面的功能，包括外形的改变、溶酶体酶的释放、超氧化物的产生和增加、黏附分子的表达[4]。TNF-α被认为是主要的前炎症细胞因子之一。已有研究证明，在TNF-α的刺激下，呼吸道上皮表达IL-8，最终反复引起呼吸道慢性炎症和肺组织损伤[5]。TNF-α还具有巨噬细胞和中性粒细胞的趋化作用，TNF-α活化内皮细胞刺激其表达相应的黏附因子，与白细胞相互作用穿过血管壁进入气道组织，形成逐级炎症反应反复发作，导致支气管小气道上皮脱落，纤毛运动减弱，肺慢性损伤和阻塞迁延不愈，发展为 COPD。可见，以 IL-8、TNF-α为主要细胞因子导致的气道炎症已经逐步被认为是COPD发病的重要机制之一。

双三口服液由广西地方特色中草药“三姐妹”、“三杈苦”和地骨皮等组成。“三姐妹”别名“伤寒头”，味辛苦，性凉，具有祛风清热解毒、化痰止咳的功效。“三杈苦”别名“三丫苦”，味苦，性寒，具有清热、祛风除湿、解毒的功效。地骨皮味甘，性寒，善于清肺中伏热，三药合用，具有解毒祛邪、清宣肺热、化痰止咳之功效。该药于1996年经南宁市卫生局批准，作为广西中医学院附属瑞康医院院内制剂生产(南药批[96]05081号)，后于2000年经广西壮族自治区卫生厅复审批准为院内中药制剂([00]09594号)。目前双三口服液已作为本院院内制剂应用广泛，临床主要用于治疗呼吸系统感染性疾病，疗效确切。我们的前期临床研究表明，双三口服液用于治疗急性支气管炎95例[6]，配合抗菌素治疗细菌性肺炎50 例[7]及 COPD 急性加重期 35 例[8]，配合激素治疗肺纤维化12例，均取得了良好的疗效。实验研究结果表明，双三口服液对呼吸道常见菌株有良好的体外抗菌作用，对炎症急性期渗出及慢性炎症或炎症后期肉芽组织增生有明显的抑制作用，可增加小鼠酚红排泌量，通过降低呼吸道对刺激物的敏感性而发挥止咳作用，对内毒素引起的动物发热模型也有较好的解热效果。本研究采用2次气管内注入脂多糖加烟熏造模，造模次日治疗组给予中药双三口服液，对照组给予地塞米松溶液，空白组和模型组均与等量生理盐水，4组均以灌胃给药28d。后行支气管肺泡灌洗并计数灌洗液中细胞数及分类，放射免疫法测定各组大鼠血清IL-8、TNF-α的含量，并计算大鼠脾脏指数和胸腺指数。研究结果显示，模型组大鼠血清 IL-8、TNF-α较空白组明显升高(P<0.01)，治疗组大鼠血清IL-8、TNF-α较模型组明显下降(P<0.05)，模型组大鼠脾脏指数和胸腺指数明显降低(P<0.05)，表明双三口服液可降低COPD大鼠血清IL-8及TNF-α水平，提高机体免疫功能，对COPD有较好的防治作用。

[1]中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组[J].COPD诊治指南(2007年修订版)，继续医学教育，2007，21(2):31-42.

[2]冯玉麟.慢性阻塞性肺疾病发病的分子机制[J].中华结核和呼吸杂志，2005，28(7):438-440.

[3]朱慧志，韩明向，丁小娟，胡建鹏.多因素慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立[J].中国临床保健杂志，2005，8(2):145-146.

[4]谢静，韩扬，李太生，邱志峰，马小军，等.重症急性呼吸综合征患者血浆细胞因子水平的动态改变[J].中华内科杂志，2003，42(9):643-645.

[5]郑芳.TNF-α结构与功能的关系[J].国外医学·免疫学分册，2003，26:60-62.

[6]蒙定水，林寿宁，陈斯宁，双三口服液治疗急性支气管炎的临床研究[J]. 中国中医急症，1998，7(5):204-205.

[7]蒙定水，林寿宁，陈斯宁，等.双三口服液合抗生素治疗细菌性肺炎的对照观察[J].广西中医药，1998，21(3):1-3.

[8]黄修解，蒙定水，谭玉萍，等.双三口服液配合西药治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期及对细胞因子和肺功能的影响[J]. 陕西中医，2009，30(8):942-943.