补肾与健脾方对骨质疏松症大鼠干预作用及下丘脑PKC蛋白表达的影响*

孙 鑫，郑洪新，燕 燕，王思程，尚德阳，邓洋洋，李 楠

(辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110032)

骨质疏松症(Osteoporosis OP)是以骨量减少、骨组织微细结构破坏为特征，继而导致骨脆性增加和骨折危险性增高的一种全身性骨骼疾病[1]。本病发病机制尚未阐明，其发生与诸多因素有关。

蛋白激酶C(PKC)是1977年在鼠脑的胞质成分中发现的一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶，由多种同工酶亚型组成，属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，以其活性依赖于Ca2+而得名，参与多种生命活动，如蛋白磷酸化、信号传递、细胞增殖和分裂、跨膜离子转运、平滑肌收缩、基因表达等[2]。本实验选取PKCα与PKCβ2作为研究对象，应用补肾益髓中药对模型大鼠进行干预，旨在探索骨质疏松症的发病机制以及补肾益髓中药的防治作用。

1 材料

1.1 动物

清洁级雌性4～5月龄wistar大鼠，169只，体重230g～270g，由中国医学科学院实验动物中心提供。

1.2 药物

实验药品:补肾壮骨益髓中药(牡蛎、鹿茸等);对照药品:骨疏康颗粒剂(辽宁康辰药业有限公司);盖天力片(东盛科技启东盖天力制药股份有限公司);健脾中药(补中益气汤方由辽宁中医药大学附属医院药房提供)。

1.3 试剂

兔抗 PKCα-抗 (Santa Cruz)、兔抗 PKCβ2-抗(Santa Cruz)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中山生物公司)、碱性磷酸酶(ALP)偶联的羊抗兔抗体(北京中山生物公司)。

2 方法

2.1 动物分组

1组:正常组;2组:假手术组;3组:模型空白组(模空组);4组:补肾中药低剂量组(低剂量组);5组:补肾中药高剂量组(高剂量组);6组:补中益气汤对照组(健脾组);7组:盖天力钙片对照组(盖天力组);8组:骨疏康颗粒对照组(骨疏康组)。

2.2 造模方法

手术摘除大鼠双侧卵巢的方法(去势法)造骨质疏松症模型。假手术组大鼠只切开皮肤及皮下组织，暴露双侧卵巢但不摘除。正常组不手术。

2.3 饲养方法

正常组及假手术组大鼠正常饮食不灌胃，其他各组大鼠正常饮食并给予相应药物灌胃，每日1次，共3个月。药物剂量:大鼠等效剂量按成人每日用药量的6.3倍计算，容积为0.875ml/100g体重。

2.4 取材

实验大鼠在最后1次灌胃后，禁食24h后取材。大鼠经10%水合氯醛注射麻醉(0.3ml/100g体重)后用碘伏消毒手术部位，采集标本。本实验保留标本包括下丘脑(置高压灭菌EP管内－70℃保存)、左后肢股骨(置塑料保鲜袋内－70℃冰箱冻存)、子宫(称取湿重)。

2.5 统计方法

3 结果

3.1 动物模型评价

3.1.1 骨密度 通过双能X线骨密度分析仪(附带“The Small Subject Scout Scan”软件)对大鼠离体股骨进行检测(扫描宽度15cm，长度可任意调节，扫描速度40mm/s，分辨率为1.0×1.0mm;结果采用单位面积内的骨矿物质含量(g/cm2)表示)，所得结果如下:与正常组比较，模空组大鼠股骨头骨密度显著降低(P<0.01);与模型空白组比较，补肾中药高剂量组可显著增加骨密度(P<0.01)，而健脾中药作用不明显，与补肾中药高剂量组差异显著(P<0.01)。

3.1.2 子宫指数 实验大鼠子宫指数统计结果显示，与正常组、假手术组相比较，模空组子宫指数明显降低(P<0.01)。

表1 各组大鼠左后肢离体股骨骨密度比较(s)

表1 各组大鼠左后肢离体股骨骨密度比较(s)

注:与正常组比较:*P<0.05;与正常组比较:**P<0.01;与模空组比较:#P<0.05，与模空组比较:##P<0.01;与低剂量比较:●P<0.05;与低剂量比较:●●P<0.01;与高剂量比较:☆P<0.05，与高剂量比较:☆☆P<0.01

组别 n 全股骨骨密度(g/cm2)正 常 组 15 0.16433±0.01466##假 手 术 组 17 0.15582±0.01138##模 空 组 21 0.14700 ±0.01035**低 剂 量 组 21 0.15186 ±0.01285**☆高 剂 量 组 21 0.16095±0.01593##●健 脾 组 19 0.14211 ±0.01127**●☆☆骨 疏 康 组 20 0.14835 ±0.01483**☆☆盖 天 力 组 20 0.15695±0.00778#

表2 各组药物对肾虚骨质疏松大鼠子宫指数影响的比较(s)

表2 各组药物对肾虚骨质疏松大鼠子宫指数影响的比较(s)

注:同表1～1

组别n子宫指数(s)正 常 组 15 2.0434±0.7178##假 手 术 组 17 1.8195±0.4311##模 空 组 21 0.2859 ±0.0469**低 剂 量 组 21 0.2930 ±0.0501**高 剂 量 组 21 0.3110 ±0.0694**健 脾 组 19 0.2773 ±0.0435**骨 疏 康 组 20 0.2835 ±0.0170**盖 天 力 组 20 0.2888±0.0684**

3.1.3 大鼠行为学指标 正常组大鼠皮毛光泽，活泼喜动，反应灵敏，食欲佳，无竖毛、弓背、聚堆等表现。模空组大鼠均出现弓背塌腰表现，其他表现如毛色变淡、蜷缩、聚堆、反应迟钝、喜静懒动、抗应激能力下降等症状不十分明显，各剂量补肾中药组及阳性对照组的弓背塌腰表现较模空组为轻。用药各组弓背塌腰症状改善率为:低剂量组33.3%，高剂量组52.4%，健脾组15.8%，盖天力组30%，骨疏康组25%。

从以上结果分析，本次实验骨质疏松症大鼠模型造模成功，且以弓背塌腰症状为肾虚模型的表征信息，补肾各组优于健脾组。

3.2 下丘脑组织中PKCα、PKCβ2蛋白表达

3.2.1 检测方法 Western blotting法检测大鼠下丘脑组织中PKCα、PKCβ2蛋白表达。经Scion Image软件进行灰度值测量后进行统计分析。

图1 大鼠下丘脑组织中PKCα Western blotting结果

3.2.2 实验结果 大鼠下丘脑组织中PKCα、PKCβ2的蛋白表达结果显示，与正常组相比，模空组显著增高(P<0.01);与模空组相比，低剂量组、高剂量组、健脾组、盖天力组、骨疏康组均有显著降低(P<0.01);与低剂量组相比，高剂量组、健脾组、盖天力组、骨疏康组有显著差异(P<0.01)。补肾各组与补脾组蛋白表达较模空组降低，趋近正常组，均有改善作用，但补肾中药优于健脾中药。

图2 大鼠下丘脑组织中PKCβ2Western blotting结果

表3 大鼠下丘脑组织中PKCα、β2 Western blotting结果对比(s，n=6)

表3 大鼠下丘脑组织中PKCα、β2 Western blotting结果对比(s，n=6)

注:同表1～1

组 别 PKCα的蛋白表达 PKCβ2的蛋白表达正 常 组 27.88857± 2.545057##☆☆ 24.58286±1.809399##☆☆假 手 术 组 33.15586± 2.690432##☆☆ 26.24429±1.603588##☆☆模 空 组 158.55000±18.89263**☆☆ 146.6129±7.179045**☆☆低 剂 量 组 47.48000± 4.364485##☆☆ 25.35429±1.912711##☆☆高 剂 量 组 32.88857± 2.89289##**●● 14.08429 ±1.139735##**●●健 脾 组 25.24000± 2.321472##**●● 13.73429±0.960917##**●●骨 疏 康 组 22.71286± 1.832109##**●●☆☆ 3.67571±0.611742##**●●☆☆盖 天 力 组 26.37571± 2.204373##**●● 12.69714±1.078884##**●●

4 讨论

4.1 骨质疏松症动物模型的选择

大鼠分布广，繁殖快，生命周期短，便于饲养，费用较低，是目前研究骨质疏松使用最多、最成熟的造模动物。Wistar大鼠具有对传染病抵抗力较强、自发性肿瘤发生率低等特点，十分适合用来进行与老年性疾病相关的实验。骨质疏松的模型也较多，包括去势骨质疏松症模型、老年性骨质疏松动物模型、维甲酸致骨质疏松模型、尾部悬吊模型等。本实验采用的去势骨质疏松症模型是一种比较成熟的模型，其作用因素单一，模型确认好，重复性好，实验结果可信度高，适用范围广，具有方便性、关联性、适应性3个特点，能很好地模拟绝经后所表现出来的骨量丢失与骨结构的一系列变化。美国国立卫生研究院、世界卫生组织都推荐用此模型作为研究骨质疏松的最佳模型。当然模型还存在一定的局限性，如单纯卵巢切除，无法完全模拟人类女性绝经前后的复杂情况，与临床实际情况有所差异。

在本实验中用该模型来模拟女性由于雌激素缺乏而引起的骨质疏松症，与《素问·上古天真论》中“天癸竭，地道不通，形坏而无子”的描述相符，由于肾中精气衰竭、月经闭绝，而使骨枯髓减导致“骨痿”。中医通过外在表现判断脏腑的变化，又可以“药”验“证”，通过观察去卵巢动物模型术后早期阶段如弓背塌腰等一系列的表现，发现其存在典型的肾虚症状，应用补肾中药后这些症状缓解或消失，由此证明此模型属肾虚。

4.2 骨质疏松症与肾、脑的关系

中医认为肾主骨，骨病首责于肾，而肾与脑的关系十分密切。“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之所合也;髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足者则骨强”(《中西汇通医经精义·脏腑所合》清·唐宗海)，十分精辟地总结了肾、脑、骨这三者的关系。肾虚的机制是复杂的，有观点认为肾虚可能与“下丘脑-垂体-性腺轴”功能的减退有关。现代医学对本病的研究也表明，本病的发生是各系统综合作用的结果，神经内分泌系统是研究的方向之一，并已有相关的研究。结果表明，骨质疏松症大鼠下丘脑组织中一些因子的变化与本病具有一定的相关性。基于以上原因，本实验选取下丘脑进行研究。

4.3 PKC与骨质疏松症的研究

1997年崔家鹏等对肾虚骨质疏松症大鼠红细胞膜PKC的活性进行了研究。结果表明，肾虚骨质疏松症模型大鼠红细胞膜PKC的活性明显降低，经密骨灵治疗模型大鼠与正常组接近[3]。2003年谷野等进行的体外实验表明，含密骨颗粒剂的血清可使UMR106成骨样细胞中的PKC活性增强，且主要以cPKCβ为主，并能促进成骨样细胞的增殖。成骨细胞是骨代谢过程中的重要细胞，其增殖有利于骨的形成[4]。

4.4 本实验研究结果的讨论

在本次实验中，补肾中药的实验结果接近正常组，其他用药组与正常组存在显著差异。补肾中药防治骨质疏松的效果优于健脾中药，一方面说明补肾中药的有效性，另一方面根据中医以药验证的理论说明本实验骨质疏松动物模型属肾虚证。

在实验中，大鼠下丘脑中PKCα与PKCβ2蛋白表达的变化明显，模空组大鼠与正常组大鼠存在显著差异，说明骨质疏松症的发生可能与下丘脑中蛋白激酶的变化密切相关，而PKC的变化可能是其中的一个重要环节。补肾、健脾中药均可调节下丘脑中PKCα与PKCβ2蛋白表达，且补肾中药优于健脾中药，说明PKC的变化可能与多方面因素相关。另外，PKC的变化也有可能是肾虚发生的生物学机制之一，但本次实验未能进一步研究其具体作用的过程，有待在今后的研究中深入探讨。

[1]刘忠厚.骨质疏松学[M].北京:科学出版社，1998.142.

[2]陈敏，唐建武.PKC亚型的生物学特性与调节功能[J].国外医学·生理病理科学与临床分册，2002，22(5):493-496.

[3]谷野，郑洪新.含密骨颗粒剂血清对UMR106成骨样细胞增殖及PKC活性的影响[J].辽宁中医杂志，2003，30(7):575-577.

[4]崔家鹏，郑洪新，刘景峰，等.补肾中药对肾虚骨质疏松症大鼠红细胞膜PKC、Ca2+-Mg2+ATP酶活性影响的实验研究[J].中国骨质疏松杂志，1997，3(3):66-69.