苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠CD4+CD25+调节性T细胞及相关调控分子的干预作用*

于明薇，孙桂芝，祁 鑫，李道睿，张培彤，吴 洁

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

肿瘤的发生、发展与机体的免疫状态密切相关。长期以来，国内外研究均表明在T细胞中存在抑制亚群，能显著下调免疫应答，并在肿瘤位点产生免疫耐受。Sakaguchi等在1995年发现鼠源性的CD4+CD25+双阳性T细胞亚群，无论在体内还是体外均表现出独特的抑制功能，Lewis肺癌移植鼠脾脏CD4+CD25+细胞数量与正常小鼠相比明显升高，有利于肿瘤耐受的形成，降低免疫系统对肿瘤的免疫应答，促进肿瘤的发生和发展。本文将探讨活血及益气活血两种不同治法中药代表苏木、苏木+黄芪对Lewis肺癌移植小鼠脾CD4+CD25+调节性T细胞表达及相关调控分子表达的干预作用。

1 材料与方法

1.1 药物

黄芪、苏木浸膏由中国中医科学院广安门医院制剂中心提供，生产批号20071121。

1.2 动物

C57BL/6小鼠，雄性，6～8周龄，体重20g±2g，清洁级，由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证号SCXK-11-00-0006)，中国中医科学院广安门医院动物室喂养(许可证号SYXK(京)2005-0001)。Lewis肺癌荷瘤鼠由中国医学科学院药物研究所提供。

1.3 试剂

FITC anti-mouse CD4、PE anti-mouse CD25、CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit、LD、MS Columns(Miltenyi Biotic)，RevertiAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，SYBR Green I Master Mix(Applied Biosystems)，引物由北京赛百盛生物技术公司合成。

1.4 仪器

FACS Calibur Flow Cytometer System(BD)，SM800解剖显微镜(Nikon)，VarioMACS磁性细胞分选仪(Miltenyi)，ABI 7500荧光定量PCR仪(ABI)，DU-640型紫外分光光度计(Beckman)等。

1.5 方法

1.5.1 动物模型复制 取传代后12d Lewis肺癌荷瘤小鼠，剥离瘤组织，选取生长良好的肿瘤组织，制备Lewis肺癌细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml(约含活细胞1×106)。

1.5.2 分组及给药 小鼠接种后随机分为3组，接种后24h始至处死止，每日灌胃给药1次。荷瘤对照组给予生理盐水灌胃0.2ml/d，苏木组、苏木+黄芪组分别给予苏木(1.67g生药/(kg·d))、苏木+黄芪(苏木1.67g生药/(kg·d)+黄芪15g生药/(kg·d))中药浸膏灌胃。

1.5.3 观察指标 苏木、苏木+黄芪对小鼠体重的影响动态观察:于接种后6、10、15、20d处死每组荷瘤小鼠各6只，称荷瘤小鼠体重，剥离肿瘤组织，电子天平称取瘤重。小鼠体重=荷瘤小鼠体重－瘤重。

苏木、苏木+黄芪对小鼠瘤重和抑瘤率的影响动态观察:于接种后6、10、15、20d处死每组小鼠各6只，剥离肿瘤组织，电子天平称取瘤重。按下列公式计算抑瘤率:抑瘤率(%)=[1－实验组平均瘤重(g)/对照组平均瘤重(g)]×100%。

苏木、苏木+黄芪对小鼠肺转移抑制率的影响:于接种后20d处死每组小鼠各6只，取肺用生理盐水冲洗，Bouin液固定，解剖显微镜下观察肺转移灶个数。肺转移抑制率(%)=[1－实验组平均肺转移灶个数(个)/对照组平均肺转移灶个数(个)]×100%。

苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠脾CD4+CD25+细胞表达的影响观察:于接种后15d取每组小鼠各6只，摘眼球放血，断颈处死小鼠，酒精消毒皮肤，迅速取脾称重、研磨，200目滤网滤过包膜及脂肪组织等，加入2mL PBS，收集脾细胞悬液，计数细胞，取约1×106细胞重悬于100μL PBS中，按照试剂说明书进行FITC-CD4、APC-CD25染色，上机检测。

小鼠脾CD4+CD25+细胞磁珠分离及纯度检测:接种后15d取每组小鼠各3只，无菌取脾，制备脾细胞悬液，溶血后按照CD4+CD25+Regulatory T cell Isolation Kit试剂说明书要求进行细胞磁性标记并分离，取1×106分选后细胞，流式细胞仪检测分选纯度。

苏木、苏木+黄芪作用后荷瘤小鼠瘤组织及脾分选后 CD4+CD25+细胞 Foxp3、CTLA-4 mRNA表达检测:实时定量 RT-PCR检测 Foxp3、CTLA-4 mRNA表达，取5×105分选后CD4+CD25+细胞和100mg瘤组织，分别提取 RNA。引物:Foxp3-S 5’-TGTGAGGACTAC-CGAGCC-3′， Foxp3-A 5′-AGGAGAAAGCGGATACCA-3′; CTLA4-S 5′-ACCTTCAGTGGT-GTTGGCTAG-3′， CTLA4-A 5′-TAAATCTGCGTCCCGTTGC-3′。PCR 反 应 条 件:95.0(C 5min，95.0(C 25sec，55.0(C 25sec，72.0(C 50sec，72.0(C 5min，循环次数为 40。设 β-actin 作为内参照。

1.5.4 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 苏木、苏木+黄芪对小鼠体重的影响动态观察

各组小鼠体重随荷瘤天数的增加呈下降趋势，各时间点各组比较无统计学差异。

2.2 苏木、苏木+黄芪对小鼠瘤重和抑瘤率的影响动态观察

表1显示，6d瘤重苏木组(0.10g±0.06g)与荷瘤对照组(0.24g±0.11g)相比存在差异(P<0.05)，10d瘤重苏木+黄芪组(0.82g±0.13g)与荷瘤对照组(1.82g±0.28g)相比存在差异(P<0.05)，各组抑瘤率随荷瘤天数的增加总体呈降低趋势。

表1 苏木、苏木+黄芪抑瘤率观察(s，n=6)

表1 苏木、苏木+黄芪抑瘤率观察(s，n=6)

时间(d)苏木组(%)苏木+黄芪组(%)58.33 50.00 10 43.96 54.95 15 34.16 37.08 6 20 16.11 26.09

2.3 苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠肺转移抑制率的影响

表2显示，各中药组小鼠20d肺转移灶个数均低于对照组，其中苏木+黄芪组肺转移抑制率为77.75%。

表2 苏木、苏木+黄芪抑瘤率观察(s，n=6)

表2 苏木、苏木+黄芪抑瘤率观察(s，n=6)

注:与荷瘤对照组比较:*P<0.05

荷瘤对照组 苏木组 苏木+黄芪组肺 转 移 灶 个 数 12±7 9±3.6 2.67±1.53*肺转移抑制率(%)—25.00 77.75

2.4 苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠脾CD4+CD25+表达的影响

15d各组小鼠脾CD4+细胞表达无差异，苏木+黄芪组小鼠脾 CD4+CD25+细胞表达(10.02±0.71)%低于荷瘤对照组(11.74±1.76)%(P<0.05)。

2.5 荷瘤小鼠脾CD4+CD25+细胞磁珠分离和纯度检测

经流式细胞仪检测鉴定，分选后小鼠脾CD4+CD25+细胞纯度为85.38% ～88.19%。

2.6 苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠瘤组织及脾分选后 CD4+CD25+细胞 Foxp3，CTLA-4 mRNA表达的影响

表3 苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠瘤组织及脾CD4+CD25+分选后细胞Foxp3、CTLA-4 mRNA表达的影响(s)

表3 苏木、苏木+黄芪对荷瘤小鼠瘤组织及脾CD4+CD25+分选后细胞Foxp3、CTLA-4 mRNA表达的影响(s)

注:与荷瘤对照组比较:*P<0.05

瘤组织(n=6)分选后CD4+CD25+细胞(n=3)组 别Ct(Foxp3/β-actin)Ct(CTLA-4/β-actin)Ct(Foxp3/β-actin)Ct(CTLA-4/β-actin )荷瘤对照组1.45±0.13 1.60±0.08 1.89±0.16 1.12±0.03 1.27±0.09苏 木 组 1.69±0.09 2.03±0.18 1.21±0.06 1.32±0.17苏木+黄芪组 1.73±0.08*2.08±0.09*1.24±0.07*

表3显示，苏木 +黄芪组荷瘤小鼠瘤组织CTLA-4 mRNA、Foxp3 mRNA表达低于荷瘤对照组(P<0.05);苏木+黄芪组荷瘤小鼠脾CD4+CD25+分选后细胞Foxp3 mRNA表达低于荷瘤对照组(P<0.05)，而CTLA-4 mRNA表达3组间无差异。

3 讨论

CD4+CD25+Treg最早在动物实验中被发现，后续研究发现，这类细胞来源于胸腺，在小鼠的外周血、脾脏和淋巴结中均可发现，且具有相似的功能。在小鼠的脾脏和淋巴组织的CD4+T细胞中，CD4+CD25+细胞约占5% ～10%。CD4+CD25+Treg发挥免疫抑制功能的详细机制尚未完全明了，目前认为主要通过作用下列靶细胞发挥作用:抑制效应性CD4+CD25-T细胞的活化增殖和免疫辅佐功能;抑制CD8+T细胞的增殖，抑制 IFN-γ、IL-2产生和CD25表达来抑制CD8+T细胞的活化，或直接杀伤CD8+效应T细胞;抑制树突状细胞成熟或下调DC的CD80和CD86共刺激分子表达;抑制T细胞依赖的B细胞产生免疫球蛋白等。

研究发现，Treg的抑制作用既发生在淋巴组织，抑制效应细胞活化的最初启动阶段，又发生在肿瘤微环境等外周性部位，抑制效应性细胞发挥杀伤肿瘤细胞等作用的最终效应阶段，Treg对抗肿瘤免疫反应的整个过程都起一定的作用。肿瘤微环境最早于1979年由Lord正式提出，是肿瘤在其发生发展过程中所处的内环境，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞，如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。局部微环境的肿瘤抗原可显著诱导特异Treg细胞生成，称为肿瘤特异Treg细胞。

Foxp3是Fox家族转录因子中的一员，有着调控CD4+CD25+Treg的发育及功能的作用。Foxp3基因高表达于淋巴组织，尤其特异性地表达于CD4+T细胞群，在其他细胞亚型和组织中也有极少量的表达，如B细胞、CD8+T细胞、脑组织、心脏、肾和肺。随着对Foxp3研究的深入，发现无论是胸腺还是外周起源的CD4+CD25+Treg细胞都能特异性地表达Foxp3，由此推测Foxp3可能是CD4+CD25+Treg细胞特异性的标志。

CTLA-4是B7/CD28家族成员，Treg结构性表达CTLA-4，CD4+CD25+Treg细胞活化后，CTLA-4的表达增加，并持续表达。CTLA-4与效应细胞上的CD80/CD86结合，将抑制信号逆向传递给效应细胞，从而抑制效应细胞功能。此外，CD4+CD25+Treg表面的CTLA-4与DC细胞表面的CD80/CD86结合，通过逆向转导的信号导致DC细胞内的吲哚氨2，3-双加氧酶(IDO)活化，IDO是色氨酸代谢所必需的酶，由于IDO的活化使得游离的色氨酸减少，从而导致了T的活化程度降低。

苏木味甘、咸、性平，具有活血散结、舒筋通络、镇静、祛痰、止痛等功效。20世纪70年代，日本学者开始苏木药理作用的研究，通过几十年来国内外不断探索与研究，发现苏木具有抗肿瘤活性。黄芪味甘、性温，归脾、肺经，可补气升阳、固表止汗、托疮生肌、利水退肿，为补气之要药。近年来研究认为，黄芪与活血药配伍后具有增强活血药抗血小板聚集作用，降低实验动物全血比黏度，降低白细胞黏附性和白细胞黏附分子的表达率等作用。本研究结果显示，益气活血组方苏木+黄芪较其单纯活血药成分苏木有较好的抑瘤、抗转移、下调CD4+CD25+细胞及相关调控分子表达的作用，提示苏木+黄芪可通过影响荷瘤小鼠调节性T细胞及相关调控分子表达改善体内存在的免疫耐受状态，而其在淋巴组织和肿瘤微环境中都表现出作用，也为中药的全身调节特点提供了佐证。