莲草方多糖与黄酮提取工艺条件的优化研究

汉丽梅 王洪波 李天来

白花蛇舌草(Hedyotic diffusa)和半枝莲药物资源丰富，两者所含有的多糖、黄酮类化合物等化学成分具有广泛的药理活性，白花蛇舌草的药理作用包括抗肿瘤、提高机体免疫力、抗化学诱变、抗感染作用等[4]。目前，白花蛇舌草的药理研究大多集中在免疫活性与抗肿瘤活性两方面。临床上主要用于治疗各种癌症、肝炎、肾炎、胃炎、呼吸系统感染、妇科疾患、阑尾炎等[5]。半枝莲具有抗癌、抗病毒、解热、保肝、抗焦油致突变、抑菌、抗氧活性及抗衰老作用等[6]。但是目前关于白花蛇舌草和半枝莲两者联合应用及对其主要活性成分的研究还很少见报道。多糖和黄酮类化合物均具有多方面的药理作用。多糖有增强免疫力、抗肿瘤活性、降血糖、抗氧化和抗衰老等功能；黄酮类化合物能预防病菌感染、抑制肿瘤、清除自由基等作用，并对高血压、高血脂等心血管系统疾病有较好的防治作用[7]。

因此本研究综合白花蛇舌草和半枝莲的药理作用，拟探讨其多糖和黄酮等活性成分在动物病毒病防治方面的应用，对其提取条件进行研究，药物开发提供一定的实验依据，对莲草方在畜牧业方面的开发应用提供一定的参考。为开发莲草方在动物性食品生产方面的应用价值，本研究以莲草方（半枝莲/白花蛇舌草质量比为1：2）为原料，对莲草方多糖和总黄酮的提取工艺条件进行了优化研究，为进一步开发白花蛇舌草和半枝莲在动物性食品生产过程中的药用价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白花蛇舌草与半枝莲，均购于沈阳同仁堂大药房。主要试剂：D-(+)-Glucose（批号 G8270），购于 Sigma；芦丁(批号080529)，购于上海融禾医药科技有限公司；石油醚、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。

1.2 主要仪器

HH-6数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；WFJ 7200型可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]；80-2台式低速离心机（上海手术器械厂）；DHG-9123A型新型电热恒温鼓风干燥箱（宁波江南仪器厂）；索氏提取器；小型粉碎机。

1.3 试验方法

1.3.1 莲草方多糖提取方法

热水提取是多糖提取最常用的方法[1]。将莲草方用石油醚回流脱脂后，60℃烘干备用。取2 g脱脂试材，根据文献报道，选定三个不同水平按照L9（34）进行水提正交试验，初步确定多糖提取条件，然后再进行单因素试验研究不同提取时间、提取温度、液固比和提取次数对多糖提取率的影响，最后确定多糖提取的最优工艺条件。将水提液浓缩到原体积的1/5左右，用6倍体积的乙醇沉淀多糖。

1.3.2 莲草方总黄酮提取方法

莲草方脱脂烘干后，准确称取4 g置于平底烧瓶中，加入乙醇溶液，90℃恒温水浴回流提取总黄酮。检测不同液固比、提取时间、乙醇浓度和提取次数对黄酮提取率的影响，在正交试验的基础上进行单因素试验，确定莲草方总黄酮的最佳提取条件。

1.3.3 多糖和总黄酮含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[2]；采用硝酸铝显色法，以芦丁为标样，在510 nm处测定其吸光值，测定总黄酮[3]。

多糖提取率（%）=（多糖含量/样品干重）×100%。

总黄酮提取率（mg/g）=总黄酮含量/样品干重。

2 结果与分析

2.1 莲草方多糖的提取

2.1.1 莲草方多糖提取正交试验

采用L9（34）正交试验进行莲草方多糖提取，初步确定多糖提取条件，提取温度（A）、液固比（B）和提取时间（C）三因素和三水平选择见表1，试验结果见表2。由极差分析可知，各因素对多糖提取的影响由大到小分别为提取温度（A）＞提取时间（C）＞液固比（B）。根据正交试验初步确定莲草方多糖提取条件为A3B1C3，即提取温度为100℃，液固比为20 ml/g，提取时间为4 h。

表1 多糖提取条件因素水平设计

表2 多糖提取条件正交试验结果

2.1.2 莲草方多糖提取的单因素试验

2.1.2.1 提取时间对多糖提取率的影响（见图1）

图1 提取时间对多糖提取率的影响

在提取温度为100℃、液固比为20 ml/g的条件下，研究提取时间对多糖提取率的影响。结果表明，随提取时间延长，多糖提取率增大，提取时间达到4 h以后，多糖提取率增有下降的趋势，因此，提取时间以4 h为宜。

2.1.2.2 液固比对多糖提取率的影响（见图2）

在提取时间为4 h、温度为100℃的条件下，研究液固比对多糖提取率的影响。结果表明，随提取液用量的增加，多糖提取率增大，当液固比达到30 ml/g以后，多糖提取率开始下降，而加水量增加会加重后序浓缩负担，加大能源消耗，因此，最佳液固比为20～30 ml/g。

图2 液固比对多糖提取率的影响

2.1.2.3 提取温度对多糖提取率的影响（见图3）

在提取时间为4 h、液固比为20 ml/g的条件下，随提取温度升高，多糖提取率逐渐增大，但水浴加热最高温度为100℃，因此100℃时多糖提取率为最佳。

2.1.2.4 提取次数对多糖提取率的影响（见图4）

图3 温度对多糖提取率的影响

图4 不同提取次数对多糖提取率的影响

用上述确定的最优工艺条件，即100℃、液固比为20 ml/g、提取时间4 h条件下，研究提取次数对多糖提取率的影响。结果表明，对莲草方反复提取，当提取次数达到2次以后，多糖提取率增幅不明显，两次提取可将莲草方多糖基本提取完全，确定提取次数为2次。

2.1.3 莲草方多糖提取条件的优化结果

研究结果表明，莲草方多糖最佳提取条件为100℃、液固比为20 ml/g、提取时间为4 h、提取2次。在此条件下，莲草方多糖提取率为6.89%。

2.2 莲草方总黄酮的提取

2.2.1 莲草方总黄酮提取的正交试验（见表3、表4）

表3 总黄酮提取因素水平设计

由表4正交试验结果可以看出，影响黄酮提取效果的因素依次为：乙醇浓度、液固比、提取时间。初步确定黄酮提取工艺组合为A1B3C3，即：乙醇浓度为60%、液固比为90 ml/g，提取时间为4 h。

表4 总黄酮提取正交试验结果

2.2.2 莲草方总黄酮提取的单因素试验

2.2.2.1 乙醇浓度对莲草方总黄酮提取率的影响（见图5）

在 90℃，液固比为 90（ml/g）条件下，提取 4 h，考察不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。

由图5可知，在低乙醇浓度的条件下，随乙醇浓度的增加，黄酮提取率增大。当乙醇浓度为50%，黄酮提取率最大，乙醇浓度继续增加，黄酮提取率下降，因此乙醇浓度应选50%为宜。

图5 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.2.2.2 液固比对莲草方总黄酮提取率的影响（见图6）

图6 液固比对黄酮提取率的影响

在50%乙醇浓度，提取时间为4 h条件下，研究不同液固比对总黄酮提取率的影响。

由图6可以看出，随提取液用量增加，黄酮提取率逐渐增加，当液固比达到90 ml/g以后，黄酮提取量反而下降，因此，选择液固比为90 ml/g比较适宜。

2.2.2.3 提取时间对连草方总黄酮提取率的影响（见图7）

图7 提取时间对黄酮提取率的影响

在50%乙醇浓度和液固比为90 ml/g的条件下，考察不同提取时间对总黄酮提取率的影响。

由图7可以看出，随提取时间的延长，黄酮提取率增加，但据文献报道，温度过高，易使黄酮被破坏，杂质溶出量增加，因此本试验条件下选择提取时间为4 h较为合适。

2.2.2.4 提取次数对莲草方总黄酮提取率的影响（见图8）

图8 提取次数对黄酮提取率的影响

在上述确定的最优工艺条件，即50%乙醇、液固比90 ml/g、90℃水浴中提取4 h条件下，对莲草方反复提取，进一步考察提取次数对总黄酮提取率的影响。

由图8可以看出，第二次和第三次提取出的黄酮含量很少，一次提取可将大部分黄酮提取出来。所以，确定提取次数为1次。

研究结果表明，莲草方总黄酮最佳提取条件为50%乙醇、液固比为90 ml/g、提取时间为4 h、提取1次。在此条件下，莲草方总黄酮提取率为6.46 mg/g。

3 小结与讨论

3.1 采用热水提取、乙醇沉淀多糖的方法，通过单因素和正交试验，确定提取连草方多糖的最佳工艺条件为：提取温度100℃、液固比20 ml/g、提取时间4 h、提取2次，在此条件下，多糖提取率为6.89%。

3.2 以乙醇为溶剂，通过单因素和正交试验，得出了莲草方总黄酮的优化提取工艺条件，即以50%乙醇为溶剂，液固比为90 ml/g，在90℃水浴加热回流提取4 h，提取1次，总黄酮提取率为6.46 mg/g。

3.3 本研究工艺简单，多糖和总黄酮提取率高，但对粗提物的分离纯化以及生物活性，还有待于进一步研究。

3.4 莲草方多糖是一种复合多糖，直接以葡萄糖为标准对照品，测定得到的总多糖与实际样品中多糖含量有差别，严格讲还应该与莲草方纯多糖进行比较，再通过换算因子进行换算，通常不经过换算的结果比换算后的结果偏小。但由于纯多糖不易得到，本文是以葡萄糖计的多糖含量，最终结果对莲草方的开发应用具有一定的参考价值。

3.5 研究提取工艺时采用先进行正交试验后进行单因素试验的方法，初步确定多糖和黄酮的提取条件，减少了在确定条件时影响因素过多、因素水平过多造成的过多的重复操作，节约了资源，同样可以获得相应的结果。

[1]王涛，赵谋明.多糖的研究进展[J].现代食品科技，2007，23（1）：103-106，95.

[2]冯颖.无梗五加果多糖与黄酮化合物的提取纯化及生物活性研究[D].沈阳农业大学博士学位论文，2006，6.

[3]陈敏敏.三味传统中药的抗肿瘤活性及有效成分研究[D].广东工业大学硕士学位论文，2005，5.