布鲁菌病的实验室检测方法

辛梅平 林瑞生 王 君

山东省安丘市疾病预防控制中心（262100）

布鲁菌病的临床表现不具特异性，其诊断必须依靠常规的细菌培养和（或）血清学方法检测高水平的特异性抗体，但是有一定的局限性。国内外学者将聚合酶链反应（PCR）应用于布鲁菌病研究的许多领域。为此，笔者将以上常用布鲁菌病实验室检测方法进行总结，以指导疾病预防控制机构在人群中开展疾病筛查和临床诊断工作。

1 血液标本细菌培养法

1.1 双相培基培养法

在100mL三角烧瓶中盛20～30mL琼脂培养基，灭菌，制成斜面，然后无菌加入10mL5%的枸橼酸钠，1%葡萄糖糖和经113℃ 10min灭菌的1%甘油肉汤。无菌取血，加入双相培养基的肉汤中，轻轻混合后倾斜，使被检血液及肉汤很好地涂在琼脂斜面上，置37℃温箱中培养，3d后观察结果。如未发现布鲁菌生长，可再倾斜，继续培养观察，如有可疑菌生长，可转种纯培养，待进一步鉴定。在3～4周未见可疑菌生长，可停止培养，定为阴性。

1.2 感染未受精鸡蛋法

取2个新鲜鸡蛋，每个接种被检血液0.2mL。把鸡蛋放在固定架上，钝端朝上，蛋壳用乙醇和碘酒消毒，然后用眼科手术刀在钝端顶部中心穿1个小孔，用3cm长的注射器针头将被检血液注入卵黄中，立即用灭菌石蜡将孔密封，置37℃温箱中培养。5d后把接种鸡卵无菌打开，用无菌的毛细管把接种血液部分的卵黄及蛋清吸出0.3～0.5mL转种于培养基上，置37℃温箱中培养，2～3d观察1次，3～4周不见可疑菌生长可停止培养。

2 常用的血清凝集反应技术

2.1 平板凝集反应

该反应是一种操作简便、特异性强及敏感性高的诊断布鲁菌病的方法。

2.1.1 操作方法

①取一洁净的玻璃板，划成12格（横数6格，纵数2格），在第1列第2格标明血清号码。②用0.2mL吸管按第1格加0.08mL，第2加0.04mL，第3格加0.02mL，第4格加0.01mL的剂量加血清样品。③加平板凝集反应抗原0.03mL于各血清格中，然后由血清量最小的格混匀。④在另外2格内1格加入0.03mL血清样品（为血清对照），另1格加0.03mL抗原（为抗原对照），然后各加入0.03mL盐水，混匀。⑤混匀后将玻璃板置于酒精灯火焰上，均匀加温，使温度达到30℃左右，在5min内记录反应结果。

2.1.2 判断标准

出现大的凝集片或小的粒状物，液体完全透明，可判定为++++；有明显的凝集片，液体几乎完全透明，可判定为+++；有可见的凝集片，液体不完全透明，可判定为++；液体混浊，只有少量粒状物，可判定为+；液体均匀混浊为阴性；血清对照与抗原对照应不出现凝集。

2.1.3 诊断标准

人、马、牛、鹿在0.02mL血清量出现++为阳性，在0.04mL血清量出现++为可疑。山羊、绵羊、猪、犬在0.04mL血清量出现++为阳性，在0.08mL血清量出现++为可疑。

平板凝集反应是20世纪80年代前应用最广泛的人、畜布鲁菌病血清学诊断方法，并作为初筛试验在畜间广泛应用。该项技术操作简便、快速，适于大面积的调查研究。但它的特异性远不如试管凝集试验和补体结合试验，易出现假阳性结果。所以，该方法不适于做确诊的可靠依据，多作为筛选检查。

2.2 试管凝集反应

试管管凝集反应为半定量试验方法，常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合，保温后观察每管内抗原凝集程度，通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价或滴度。试验中，由于电解质浓度和pH值不适当等原因，可引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应，因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。

2.2.1 操作方法

取小试管5～10只，放于试管架上。第1管加盐水2.3mL，第2管不加，第3管到最后一管管各加0.5mL盐水。然后，用1mL吸管取血清样品0.2mL加入第1管中，混匀后吸1mL加入第2、3管各0.5mL，第3管混匀后再吸0.5mL加人第4管，以此类推到倒数第2管吸0.5mL弃掉。将试管凝集抗原充分混匀后，做10倍稀释，然后从第2管开始每管加入0.5mL，加入抗原之后，血清的最终稀释倍数为从第2管开始1∶25、1∶50、1∶100……l∶3200，第1管为血清对照，最后1管为抗原对照。然后充分混匀，放于37℃温箱中18～20h后取出，在室温下放置1～2h观察结果。血清对照为清亮透明无沉淀，抗原对照为均匀混浊。在两种对照管都成立的情况下，方可判定试验管，否则应重做。

2.2.2 判断标准

液体完全透明，菌体呈伞状沉淀，可判定为++++；液体近于完全透明，菌体呈伞状沉淀，可判定为+++；液体略微透明，菌体呈较薄邹伞状沉淀，可判定为++；液体不透明，管底有不很明显的伞状沉淀，可判定为+；液体不透明，无伞状沉淀，可判定为-。

2.2.3 诊断标准

人及牛、马等大家畜血清凝集价在1∶100（++）以上为阳性，1∶50（++）为可疑；绵羊、山羊、猪及犬等小家畜血清在1∶50（++）以上为阳性，1∶25（++）为可疑。

试管凝集反应的敏感性很高。患者常于发热的第1天起就开始出现抗体，处于潜伏期及隐性感染的患者亦可出现阳性结果。随着体温的升高和症状的出现，凝集价急剧上升，急性发病2～3周后，凝集效价已呈现明显的阳性，因此可作早期诊断；若多次做凝集反应试验，凝集价不断上升，则诊断意义更大。高凝集价可保持1年之久，然后显著下降，以后在4～5年或更长时间凝集反应呈阴性或保持起伏不定的凝集价，如复发，凝集价又升高，因此，此方法可用来判定疾病活动与否。

血清凝集反应技术中最重要的是试管凝集反应，是比较稳定、特异、具有较高敏感性的成熟方法。它具有国际公认的标化方法、标准技术操作程序、标准血清、国际换算单位以及人、畜的诊断标准。

3 全血聚合酶链反应技术

PCR又称无细胞克隆或体外基因扩增，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法，具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等优点，是分子生物学技术的一项突破。PCR技术模拟体内DNA的自然复制过程，引物按照碱基配对原则与DNA模板互补结合，在DNA聚合酶的作用下，从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性、退火、延伸等一次循环，DNA链数量增加1倍。经过数次循环后，使fg水平的模板DNA达到ng水平，再用电泳方法检测扩张的产物。

3.1 全血DNA的提取[1]

取EDTA抗凝血200μL，1200r/min离心5s，弃去上清，加200μL双蒸馏水重悬沉淀，煮沸5min以裂解细胞核细胞核，12000r/min离心1min，取上清液10μL直接进行PCR扩增。

3.2 引物[1,2]

引物是由编码牛种布鲁菌3lKD外膜蛋白基因设计，华美公司合成。

B15'-GCAGTCHGACGTTGCCTATT-3'

B25'-GTCTGAGGTGTTCACCCTT-3'B1-B2扩增片段230bp

B35'-AGTCAGACGTTGCCTATTG-3'

B45'-GTGTTCAGCCTTGATATCG-3'

B3-B4扩增片段330bp

B55'-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3'

B65'-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3'

B5-B6扩增片段223bp

3.3 操作方法[2]

见表1。

表1 PCR实验加样方法

94℃作用5min进入循环，94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，引物B1和B2实验组行40个循环、B3和B4实验组行30个循环、B5和B6实验组行36个循环，最后一个循环结束，72℃延伸5min。PCB扩增完毕，加载样缓冲液5μL，混匀。取8μL在1.5%琼脂糖凝胶上电泳1h，EB染色，紫外检测仪观察结果。

文献[1,2]研究发现，B1-B2和B3-B4两对引物敏感性高、特异性好，且稳定；而B5-B6结果不稳定。所以，B1-B2和B3-B4两对引物可以用于诊断布鲁菌病，B5-B6仍有待于进一步探讨和证实。布鲁菌病有复发的倾向，用常规方法诊断比较困难，而PCR技术可用于该类病例随访和诊断的方法。因此，PCR技术用于诊断布鲁菌病有着广阔的应用前景。

[1] 王季秋,李铁锋,张贵珍,等.全血聚合酶链反应试验在诊断布氏菌病中的应用观察[J].中国地方病防治杂志,2003,18(1):10-12.