夏秋采收荆半夏中鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷的含量比较

肖 锦 王光忠 刘焱文

湖北中医药大学（430063）

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thumb.）Breit.的干燥块茎，其味辛，有毒，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效[1]。产于湖北荆门地区的荆半夏为道地药材，野生植物资源较丰富，多为夏秋二季采挖[2]。诸多文献报道，半夏主要活性成分为生物碱、有机酸等类型的化合物，并将鸟嘌呤核苷作为含量测定指标控制该药材质量[3,4]。次黄嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷是核苷酸的代谢产物，也是形成嘌呤碱的重要原料，是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性[5]。本文采用RP-HPLC分析方法，对夏秋两季采收荆半夏中鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷的含量进行了比较分析，结果表明夏季采收荆半夏有效成分含量较高，可望为该中药最佳采收季节提供一定参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AgiLent 1100 series 高效液相色谱仪（G1322A排气阀，G1311A泵，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器，AgiLent色谱工作站）；HypersiL C18色谱柱；十万分之一天平（Sartorius BP211D）；万分之一天平（Metter toLedo AL204）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为40kHz）。

1.2 药材与试剂

药材：荆半夏生药材采自于湖北省荆门地区（夏季荆半夏采于2009年5月，秋季荆半夏采于2009年10月）。经湖北中医药大学鉴定教研室张秀桥副教授鉴定为半夏Pinellia ternata（Thumb.）Breit.的干燥块茎。

试剂：鸟嘌呤核苷（含量＞99%）、次黄嘌呤核苷（含量＞99%）均购自Sigma—ALdrich公司；甲醇（分析纯，上海振兴化工一厂）；磷酸（分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂），双蒸水。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

分别精密称取鸟嘌呤核苷4.8mg、次黄嘌呤核苷4.5mg，置25mL量瓶中，加水溶解并定溶至刻度，摇匀；精密量取0.2mL，置于5mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每mL含有鸟嘌呤核苷7.68µg、次黄嘌呤核苷7.2µg）。

2.1.2 供试品溶液的制备

取半夏药材粉末（60目）约1g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，精密加水50mL，密塞，超声提取30min后，精密吸取上清液25mL，水浴浓缩至适量，用水溶解并转移至5mL量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，以0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液[3]。

2.2 色谱条件

色谱柱为HypersiL C18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；流动相见表1；流速0.5mL/min；检测波长λ=254nm；柱温30℃。

表1 流动相梯度

2.3 系统适用性实验

按2.1.2项下方法制备供试品溶液，取该溶液10μL，注入高效液相色谱仪，鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷的保留时间分别为19.640min和11.149min。理论塔板数以次黄嘌呤核苷计不低于9000，鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷与相邻未知色谱峰分离度均＞1.5，见图1。

图1 HPLC色谱图（图中1为次黄嘌呤核苷，2为鸟嘌呤核苷）

2.4 线性关系的考察

按对照品溶液的制备项下操作，得混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL，分别置5mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密吸取上述不同浓度混合对照品溶液10μL进样，测定峰面积。以进样浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标计算回归方程。结果：鸟嘌呤核苷的回归方程为：Y=48.038X+14.27，相关系数：r=0.9999，在3.84～30.72μg/mL范围内线性关系良好；次黄嘌呤核苷的回归方程为Y=38.31X+366.13，相关系数：r=0.9999，在3.6～28.8μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验

精密吸取混合对照品溶液10μL，连续进样6次，以峰而积计算RSD（%），鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷峰面积的RSD分别为1.23%和1.17%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验

精密称取夏季荆半夏样品（粉碎过60目筛）6份，按照2.1.2项下的方法制备供试品溶液，进样测定，结果夏季荆半夏中鸟嘌呤核苷平均含量为219.05μg/g（RSD=0.12%），次黄嘌呤核苷的含量为82.25μg/g（RSD=0.33%），表明该方法的重复性良好。

2.7 稳定性实验

精密称取夏季荆半夏药材（过60目筛），按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，10h进样10μL，进行含量测定，结果鸟嘌呤核苷的RSD=0.13%；次黄嘌呤核苷的RSD=0.50%，表明供试品溶液在10h之内稳定性良好。

2.8 加样回收率实验

取已知鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷含量荆半夏样品约0.5g，共9份，精密称定，分别按鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷含量的80%，100%，120%加入对照品溶液，每个平行3份，按供试品溶液的制备方法制成加样回收供试品液。取10μL进样测定，计算含量。结果鸟嘌呤核苷低、中、高3个加入量的回收率（n=3）分别为103.59%、103.63%、103.9%；RSD分别为2.66%、1.46%、1.55%；平均回收率（n=9）为103.71%；次黄嘌呤核苷低、中、高3个加入量的回收率（n=3）分别为97.75%、97.59%、99.23%;RSD分别为0.17%、0.36%、0.68%；平均回收率（n=9）为98.19%，表明该方法可靠性强。

2.9 样品含量测定

分别精密称取不同产地，夏季、秋季采荆半夏药材（粉碎，过60目）1g，按2.1.2项下方法制备供试液。精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨 论

3.1 半夏传统采收时间是夏秋两季，夏季（5～6月）即为农历“立夏”至“夏至”，秋季（9～10月）即为农历“秋分”至“霜降”。据文献报道[6]，半夏的最佳采收时间为夏季6月和秋季9月，分别是农历的“芒种”至“夏至”和农历“秋分”前后。但是，本实验研究结果表明，夏季采收荆半夏药材中鸟嘌呤核苷和次黄嘌呤核苷的含量均高于秋季采收的药材，秋季采收荆半夏药材中次黄嘌呤的含量甚微；而且夏季采收荆半夏药材的性状明显优于秋季采收药材，其粒径较大，色泽更白，质地更为坚实。因此，本实验数据为荆半夏采收季节提供了参考依据。

3.2 本文制定的含量测定方法易于操作，分离度高，重现性良好，可靠性强，从而为荆半夏的质量控制提供了一种简便易行的含量测定方法，可望作为再版中国药典收订时的参考依据。

[1] 中国药典.一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2] 龚千锋,丁安伟,孙秀梅,等.中药炮制学[M]. 北京:中国中医药出版社,2003:324-330.

[3] 张科卫,吴皓,崔小兵,等.不同产区半夏药材中鸟苷含量的测定[J].中成药,2000,22(11):769.

[4] 鹿野美弘,有元良帜子,赵昌代,等.小半夏加茯苓汤ぉけゐ[半夏]の指标物质[J].生药学杂志,1987,41(4):282.

[5] Kinahan JJ,KowaL EP,Grindey GB. BiochemicaL and antitumor effects of the combination of thymidine and 1-β-D-arabinofuranosyLcy-tosine against eukemia L1210[J]. Cancer Res,1981,41(2):445.

[6] 白权,李敏.半夏采收加工标准探讨[J].中国药师,2006,9(5):417-419.