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高胆红素血症对新生豚鼠畸变产物耳声发射的影响*

2010-06-05叶海波时海波于栋祯陈正侬殷善开

听力学及言语疾病杂志 2010年4期
关键词:耳声毛细胞豚鼠

叶海波 时海波 于栋祯 陈正侬 殷善开

高胆红素血症对新生豚鼠畸变产物耳声发射的影响*

叶海波1时海波1于栋祯1陈正侬1殷善开1

目的 通过动态观察高胆红素血症新生豚鼠畸变产物耳声发射(DPOAE)及其对侧抑制现象的变化,探讨高胆红素血症对耳蜗和/或脑干听觉传出通路内侧耳蜗橄榄系统功能的影响。方法 20只新生豚鼠分为实验组和对照组各10只,分别腹腔注射胆红素100μg/g和等量生理盐水。两组于给药前、给药后2、4、6、8小时在对侧耳无声刺激及70 dB SPL白噪声刺激两种条件下测试DPOAE,观察两组DPOAE及对侧抑制现象的动态变化。给药后8小时行全耳蜗基底膜铺片定量观察毛细胞损伤情况。结果 对照组给药前后DPOAE幅值无变化,对侧抑制现象始终存在。实验组给药后DPOAE幅值逐步下降,给药后2小时起对侧抑制现象消失,其中5只豚鼠在给药后8小时DPOAE幅值及对侧抑制现象呈现不同程度的恢复。两组豚鼠耳蜗基底膜铺片观察毛细胞形态未见异常。结论 高胆红素血症早期可能损害耳蜗毛细胞的主动机械活动及耳蜗传出神经系统,此损害部分为可逆性的。DPOAE及其对侧抑制现象是评估胆红素脑病严重程度的有效指标。

高胆红素血症; 耳声发射; 对侧抑制; 耳蜗传出系统

60%的新生儿可出现高胆红素血症,在某些患儿中可以诱发中枢神经毒性作用,即胆红素脑病[1]。由于听觉系统对胆红素毒性高度敏感,听觉损伤常常先于其他中枢功能障碍,或者单独显症,甚至在部分“生理性黄疸”患儿中也可出现各种急性或慢性显现的听功能损害[2,3]。大量的临床及基础研究提示高胆红素可致听觉外周与中枢均受损,然而,实验结果及结论并不一致[4~6],而且缺乏高胆红素血症时有关听觉外周与中枢功能的同步性研究的报告。

畸变产物耳声发射(DPOAE)的幅值与耳蜗的主动机制以及耳蜗外毛细胞的功能状态相关。此外,脑干听觉传出系统也可影响DPOAE的幅值,一侧声刺激通过内侧耳蜗橄榄系统(medial olivocochlear system,MOCS)形成交叉至对侧耳蜗的抑制性投射,可抑制对侧耳蜗外毛细胞的主动运动、抑制耳声发射幅值[7,8],此即为耳声发射对侧抑制效应(contralateral suppression,CS)。本研究通过动态观察急性高胆红素血症新生豚鼠DPOAE、CS及耳蜗毛细胞图的变化,探讨高胆红素血症对耳蜗和/或脑干听觉传出通路功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和前期处理 选用生后5~7天的健康纯白红目豚鼠20只,体重70~120 g,雌雄不拘,耳廓反射灵敏,四肢运动自如,肌张力正常;显微镜下清除外耳道耵聍,检查中耳无炎症反应。随机分为生理盐水对照组和胆红素实验组,每组各10只动物。以盐酸氯胺酮30 mg/kg行后肢肌肉注射麻醉,电热毯维持肛温在37.5~38.5℃,局部消毒后切除双侧耳屏软骨至完全显露外耳道口,彻底缝合止血,饲养2~3天伤口愈合后,进行后续实验。在预实验探索测试技术的过程中发现,不切除耳屏的动物测得的DPOAE值稳定性相对较差,在某些频率有5 dB左右的波动;而切除耳屏后的测试结果稳定,三次以上的DPOAE曲线可以达到完全重合,且对测试值的影响及动物的伤害均不大,故在正式实验过程中均采用了上述处理方法。

1.2 高胆红素血症动物模型制作 参照陈舜年等[9]的方法建立高胆红素血症豚鼠模型,胆红素溶液均于注射前新鲜配制,避光保存及使用。称取晶体胆红素(Sigma公司),每20 mg溶于1 ml 0.5 M NaOH溶液中,加入双蒸水9 ml,用0.5 M HCl调节p H至8.5。实验组豚鼠腹腔注射胆红素剂量为100μg/g,对照组豚鼠腹腔注射等量的生理盐水。

1.3 行为学评价 参照Shaia的评价标准[5],依据豚鼠神经行为、躯体运动及对外界刺激的反应,将实验动物神经行为学症状分为6个等级:0分为正常;1分为极轻度异常,表现为后肢共济失调(运动失调);2分为轻度异常,表现为后肢共济失调和张力障碍,翻正反射轻度异常;3分为中度异常,表现为后肢共济失调和张力障碍进一步加重,翻正反射时间延长;4分为重度异常,表现为运动减少、动作迟缓,甚至俯伏不动、对外界刺激无逃避反应,偶尔表现兴奋,易激惹,翻正反射消失;5分为濒死状,表现为发作性的角弓反张、癫痫发作和濒死状呼吸。

1.4 DPOAE检测 两组动物均置于符合GB/T16403(1996)标准的隔声屏蔽室中,采用美国GSI(格雷森-斯塔德勒公司)的GSI 60耳声发射仪和诊断用听力计(AA-38E,RION公司)行DPOAE及CS检测。给药前及给药后2、4、6、8小时分别在对侧耳无声刺激及噪声刺激两种条件下测试DPOAE,记录DPOAE及CS的动态变化。

以自制固定器固定豚鼠头部,将GSI 60耳声发射仪探头以自制橡胶耳塞封套后置于外耳道口,使外耳道完全密封。DPOAE记录参数设置如下,原始纯音频率比f2/f1=1.2,L1=65 dB SPL,L2=55 dB SPL,测定在f1=1、1.3、1.6、2、2.5、3.2、4、5、6.4 k Hz 9个不同频率时DPOAE的幅值,以DPOAE幅值大于本底噪声3 dB SPL为引出标准。重复测试2~3次,取各频率幅值的均值作为各频率DPOAE的幅值。DPOAE测试完成后,将听力计耳机插入对侧外耳道口,用支架固定。在70 dB SPL白噪声持续刺激下,记录测试耳的DPOAE幅值,各项测量参数及方法同前。对侧耳无声刺激时DPOAE幅值与给予70 dB SPL白噪声刺激时DPOAE幅值的差值计为△DPOAE,该差值即为对侧抑制,反映耳蜗传出系统功能状态。每次测试间休息数分钟,以减少因听觉疲劳产生的影响。

1.5 耳蜗毛细胞图 两组动物在给药后8小时完成DPOAE检测后均迅速于过量麻醉下断头处死,常规制备全耳蜗基底膜铺片[10],经纤毛和表皮板染色(F-actin荧光染色法)后观察。染色方法简述如下:将基底膜以0.01 M PBS中漂洗3次,每次5分钟,随后移入TRITC phalloidin(鬼笔环肽,Sigma P1951,1:400),避光放置30分钟,取出样品经0.01 M PBS漂洗后铺放于载玻片上的甘油中,基底膜的网状膜面向上,盖玻片覆盖后周缘以中性树胶封固,在荧光显微镜(尼康Eclipse 80i)下观察。按丁大连等[9]的方法对内、外毛细胞进行计数并将结果逐一输入LS软件,该软件自动将输入结果与数据库中健康豚鼠的耳蜗毛细胞参考值进行比较并生成耳蜗毛细胞图。

1.6 统计学处理 采用SAS 8.2统计软件处理所有数据结果,实验数据均以¯x±s表示。两组间DPOAE幅值的差异性采用单因素方差分析,实验组豚鼠在有、无对侧耳噪声刺激下DPOAE反应幅值之间的差异性采用配对t检验。实验组和对照组行为学评分比较采用非参数分析法Kruskal-Wallis检验,以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型鉴定及行为学评价 实验组豚鼠在给药后2~8小时出现明显的神经行为学改变,以注射后8小时症状最为严重(表1)。行为学评分经Kruskal-Wallis检验,每个时间点行为症状得分差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。

2.2 DPOAE及CS 在对侧耳无声刺激状态下,对照组给药前、后检测耳DPOAE幅值差异无统计学意义(P>0.05);实验组给药后各频率DPOAE幅值下降,随时间的推移其幅值进一步下降;实验组给药后2、4、8小时DPOAE幅值与对照组及给药前相比差异均有统计学意义(P<0.05)(表2)。

与对侧耳无声刺激相比,用药前对侧耳给予噪声刺激两组豚鼠的DPOAE幅值均有降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与给药前相比,对照组给药后各个时间点的△DPOAE未出现明显变化(P>0.05)。实验组给药后各时间点之间的△DPOAE逐渐降低并最终趋于0,与给药前相比差异有统计学意义(P<0.05)(表3);其中5只豚鼠给药后8小时△DPOAE有不同程度的恢复。

2.3 耳蜗毛细胞图 与正常对照组豚鼠相比,实验组豚鼠腹腔注射胆红素后8小时耳蜗基底膜铺片及耳蜗毛细胞图无异常(图1、2)。

3 讨论

大量的临床及动物实验研究[2,3,11]已经证实高胆红素血症可损伤包括脑干听觉核团在内的特定区域,如苍白球、丘脑下核、海马、动眼神经核、耳蜗腹侧核及小脑皮层Purkinje细胞。胆红素脑病是高胆红素血症常见的并发症,严重威胁人类的健康。现已明确,未结合胆红素,亦称游离胆红素是主要致病物质,它可通过兴奋毒性作用及影响能量代谢造成特定的中枢功能障碍[2,4]。豚鼠腹腔注射游离胆红素溶液后,胆红素经体液吸收进入血液循环,在给药4~8小时后血清胆红素浓度明显增高,并出现异常神经行为[9]。本研究使用的新生豚鼠听力发育阶段与新生儿相似,非常适合出生早期高胆红素血症导致听觉损害的研究。

表1 两组豚鼠各时间点的行为学评分(分)(n=10)

表2 各频率两组豚鼠用药前后DPOAE幅值变化

表2 各频率两组豚鼠用药前后DPOAE幅值变化

注:*与前一个时间点比较,P<0.05

f1(k Hz)对照组给药前 给药后2小时 给药后4小时 给药后8小时实验组给药前 给药后2小时 给药后4小时 给药后8小时1 5.05±2 5.69±2.89 5.8±1.84 5.35±2.63 7.1±2.84 4.1±2.18*3.55±1.45*2.55±0.56*1.3 6.9±4.32 7.94±3.38 7.65±4.9 7±4.03 8.2±5.42 6.2±4.61*4.45±2.57*4.6±2.12*1.6 9.9±4.43 12.19±6.63 11.25±6.87 10.75±5.82 5.25±2.9 2.9±1.89*3.2±1.54*2.65±1.79*2 13.9±8.47 16.06±8.6 16.05±7.59 15.35±6.77 7.65±4.14 4±2.89*3.3±1.99*3.1±1.22*2.5 16.65±7.62 17.69±7.5 18.1±7.98 17.35±8.63 10.15±4.22 7.35±2.84*6.9±2.44*5.4±3.02*3.2 15.7±6.09 16.75±6.92 16.4±6.66 16.35±5.86 15.05±2.92 10.7±2.55*8.45±4.55*6.1±4.63*4 11.95±6.47 15.38±4.59 13.95±4.42 13.8±4.02 16.95±1.98 13.15±3.33*8.5±6.67*5±2.99*5 11.8±5.99 14.38±5.68 15.7±4.38 14.75±5.29 18.5±2.45 15.3±1.62*11.3±4.91*10.4±4.06*6.4 19.8±6.54 21.19±6.19 20.05±5.5 20.75±5.28 26.4±5.24 24.9±4.03*21.25±6.44*17.25±9.3*

表3 各频率两组豚鼠给药前后对侧耳无声刺激与对侧耳给予70 d B SPL白噪声时DPOAE振幅的差值(dB,n=10)

图1 两组豚鼠给药后8小时的耳蜗毛细胞缺失图a.对照组(n=10);b.实验组(n=10)

图2 实验组给药后8小时的耳蜗毛细胞铺片,未见纤毛或表皮板损害表现(F-actin荧光染色×400)

对于高胆红素血症时耳蜗是否受累一直存在争议。Lafreniere等[12]于1993年报道了在高胆红素血症患儿中能够引出DPOAE,提示耳蜗功能正常,损害部位在蜗后。然而,Sheykholeslami等[13]对3例严重高胆红素血症所致聋儿的临床研究表明,所有患儿的OAE(包括DPOAE和TEOAE)均异常,只能引出部分低频或高频的反应,提示至少部分耳蜗外毛细胞功能受损。本研究中实验组豚鼠的耳蜗基底膜铺片及耳蜗毛细胞图显示,新生豚鼠腹腔注射胆红素后8小时的内、外毛细胞图正常,毛细胞的纤毛和表皮板未见损伤。这与Shapiro等[5,14]利用生后16至17天的先天性高胆红素血症大鼠模型(Gunn rat)检测耳蜗微音器电位、耳蜗毛细胞钙调节蛋白、微清蛋白的表达所证实的耳蜗毛细胞不受高胆红素血症影响的结果相符合。然而本研究结果显示,实验组豚鼠在给药后各频率的DPOAE振幅下降,且随时间的推移逐步加重;给药后8小时,行为学异常表现最为严重,DPOAE幅值下降也最显著。推测DPOAE幅值下降的直接原因可能与高胆红素血症早期损害了耳蜗毛细胞耗能的主动机械活动有关。

王洪田等[15]研究发现,动物在去大脑强直后的DPOAE幅值显著下降,提示听皮层高级中枢对耳声发射存在正向调控作用。本实验中,实验组动物出现了显著的胆红素脑病表现,因此,推测高胆红素血症时听皮层功能受到抑制,听皮层高级中枢对耳声发射正向调控作用减弱,进而导致DPOAE幅值下降。

对侧声刺激可抑制耳声发射幅值的现象已在哺乳动物及人类检测中得到证实[16,17]。该现象的解剖学基础在于,一侧声刺激可诱发交叉至对侧MOCS的脑干听觉传出通路,并通过释放乙酰胆碱影响MOCS传出神经纤维支配的外毛细胞,抑制对侧外毛细胞的主动运动,引起DPOAE幅值的下降[18~20]。因此,观察耳声发射的对侧声抑制现象可以了解听觉脑干传出通路的功能。本研究实验组动物在腹腔注射胆红素后2小时即记录不到CS,提示胆红素作用后声刺激无法兴奋MOCS,因此,不能抑制对侧外毛细胞的能动性,DPOAE的幅值不再下降,说明高胆红素血症早期即可造成脑干听觉传出通路的病理性损害。实验组有5只豚鼠在给药后8小时DPOAE幅值及CS出现不同程度的恢复,提示胆红素对MOCS传出神经系统的损伤有部分是可逆的。

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(2009-11-09收稿)

(本文编辑 周涛)

Effect of HyperbiIirubinemia on Distortion Product Otoacoustic Emissions in Newborn Guinea Pigs

Ye Haibo,Shi Haibo,Yu Dongzhen,Chen Zhengnong,Yin Shankai
(Department of OtoIaryngoIogy,AffiIiated Sixth PeopIe’s HospitaI,Shanghai Jiao Tong University,Institute of OtoIaryngoIogy,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai,200233,China)

Hyperbilirubinemia; Otoacoustic emissions; Contralateral suppression; Medial olivocochlear system

10.3969/j.issn.1006-7299.2010.04.012

R764.5

A

1006-7299(2010)04-0350-05

* 2008年度上海市科委“创新行动计划”基础研究重点项目基金(08JC1412700)及2007年度教育部留学回国人员科研启动基金资助

1 上海交通大学附属第六人民医院耳鼻咽喉科,上海交通大学耳鼻咽喉科研究所,上海交通大学眩晕疾病诊治中心,上海市听力测试中心(上海 200233)

叶海波,男,上海人,主治医师,在读博士。研究方向:耳科学基础和临床。

时海波(Email:haibo99@hotmail.com)

【Abstract】Objective To explore the function of cochlea and medial olivo cochlear system(MOCs)in hyperbilirubinemic guinea pigs by detecting the distortion product otoacoustic emissions(DPOAEs)and contralateral suppression(CS).Methods The DPOAEs amplitude was measured with and without 70 d B SPL white noise contralateral stimulation in the ears of 20 healthy newborn guinea pigs,which were randomly divided into two groups(control group and experimental group).DPOAE was recorded at 2,4,6 and 8 hours after peritoneal injection of saline for control group,and bilirubin for experimental group.Cochleogram was obtained from cochlear surface preparation in experimental group after the test.ResuIts There was no statistical change in DPOAEs amplitude and CS in control group.However,the amplitude of DPOAEs decreased in experimental group,the contralateral acoustic stimulation had no significant effect on amplitude of DPOAEs measured ipsilaterally after bilirubin injection.There was part of recovery on amplitude of DPOAEs and CSin five guinea pigs with no abnormalities in cochlear hair cells in experimental group at 8 hours after peritoneal injection.ConcIusion Our findings suggest that hyperbilirubinemia results in impairment of MOCs and mechanical activities of cochlear hair cells.The bilirubin injected animals showed some part of reversal of abnomalities.The DPOAEs and CS could be an effective ways to evaluate the severity of bilirubin encephalopathy.

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