东祁连山高寒草地优势植物根部入侵真菌的初步鉴定

杨淑君,陈秀蓉,姜 平,杨成德,叶 震

(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室 ,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心甘肃兰州 730070)

根部入侵真菌是指已经侵入寄主植物根部,经表面消毒又不能将其杀死,肉眼观察又看不到症状的一类真菌。不同于土壤真菌,后者吸收植物根系分泌物或营腐生活,分解植物残体,在自然界物质循环中起重要作用。另外,它又不同于菌根菌,因为菌根菌可为寄主提供一些水分和营养[1]。我国微生物学者在草地微生物方面所做的工作主要集中在内蒙古草原和东北羊草草原上,且主要针对土壤微生物,大都应用传统的方法对土壤微生物数量季节的变化,微生物量及环境条件对微生物的影响等方面的研究[2-4]。南志标[5-7]等对甘肃环县温带典型草原区种植的不同年限的沙打旺植株及黄土高原区苜蓿与小麦轮作系统的根部入侵真菌进行了研究,在沙打旺根部共获得31种真菌,在轮作系统的小麦根系和苜蓿侧根分别得到26和23种真菌,其中22种为共同的根部入侵真菌,而对高寒草地优势根际真菌及其功能的研究较少报道。

通过采用组织培养分离法,对甘肃省天祝县金强河高寒草地4种典型草地类型的样地所采集的优势植物进行分离、纯化、鉴定、保存,以期为进一步研究根部入侵真菌种群动态及生境提供依据。

1 材料和方法

1.1 采样地概况

试验地甘肃省天祝县金强河上游永丰滩甘肃农业大学高山草原试验站。海拔2 900～4 200 m,地理坐标 N 37°11′～37°11′,E 102°29′～102°33′,年均降水量416 mm,年蒸发量1 430.4 mm,年均气温-1℃,7月平均气温12.7℃,1月为-18.7℃,大于0℃的积温为1 380℃,无绝对无霜期,属高寒天然草地。

1.2 供试材料

选择当地4种典型草地类型中的优势牧草或亚优势牧草9种,分离其根部入侵真菌,珠芽蓼草地有珠芽廖(Polygonum viviparum)狭穗针茅(Stipa regeliana)、麻花艽(Gentiana straminea);禾草草地有草地早熟禾(Poa pratensis)、冷蒿(Artemisia f rigida)、紫花针茅(Stipa purpurca);沼泽草地有平车前(Plantago depressa);蒿草草地有线叶嵩草(Kobresia capilli f olia)、秦艽(Gentiana macrophylla)。

1.3 采样方法

选择生长正常有代表性的植株,取大小相近的植株全根系,每种5株,4℃保存,3日内分离完毕。

1.4 分离培养

采用常规组织分离培养[8],培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),灭菌后在超净工作台上分离。选取植株主根上、中、下部及侧根中部,在清水中用力振荡4～5 min,倒去清水,用 1%HgCl2溶液消毒 2 min,灭菌水清洗3次,用灭菌滤纸吸去表面水分后切成长4 mm小段,混匀后随机取样,置于PDA培养基上,每皿5小段,重复4次,置 22 ℃下培养。5 d后观察菌落形态,7 d后测定菌落大小,每种菌测定30个孢子大小。如出现镰孢菌,则将其立即转入马铃薯蔗糖培养基(PSA)上。同时对其他各种真菌,纯化后置于4℃下保存备用。

1.5 鉴定

将经单孢纯化的真菌菌丝接种到PDA和PSA两种培养基上,于25℃恒温光照培养箱内培养,5 d后记录菌落直径大小、颜色变化;用载片培养法[8]观察大、小型分生孢子和厚垣孢子形状及着生方式;产孢细胞形态特点;并测量30～50个镰孢菌大、小孢子的长和宽,参考有关文献[9-16],进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 各植物入侵真菌的数量和比例

分离的9种牧草根部共发现真菌8属,分别是镰孢菌属(Fusarium sp.)、丝核霉属(Rhizoctnia sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、Chlamydomucos sp.)、黑葱花属(Periconia sp.)、镶孢霉属(Coniathecium sp.)、丝葚霉属(Papulaspora sp.)、青霉属(Penicillium),在鉴定种中镰孢菌为优势种,共8种占28.57%,曲霉次之,共4种占 14.29%,青霉 2种占 0.07%,其它属相对较少。此外,不同牧草根部入侵真菌种群和数量不同,草地早熟禾上有4株真菌,属于3个属,分别为曲霉(Aspergillus sp.)4、青霉(Penicillium sp.)和黑葱花属(Periconia sp.),而麻花艽和紫花针茅上都仅仅有1种,分别是镰孢菌(Fusarium sp.)6和镰孢菌(Fusarium sp.)8。

表1 9种牧草根部入侵真菌种群Table 1 Root-invading fungi of 9 Herbage Species

2.2 各寄主植物入侵真菌的形态特征

2.2.1 平车前 (1)丝葚霉(Papulaspora sp.)属真菌界半知菌亚门,丝孢纲,无孢目。菌落灰色,大型,直径5～6 cm,菌表平铺,生长均匀,较厚,絮绒状至粗绒状。菌背黑色至灰色,菌丝初无色,很细,后变淡灰色,粗3.53～5.88 μ m。有隔膜,菌丝上大量形成球状膨大体,或呈念珠状。单生、串生、顶生,大小(24.76～38.18)×(21.17～38.81)(26.83～24.25)μ m,后期大量形成丝葚状体,不产孢(图1)。(2)镰孢菌(Fusarium sp.)1属真菌界半知菌亚门,孢纲,孢目。菌落白色,中型,直径 1.5 m,稍隆起,菌表致密,菌背中央黄褐色,边缘米白色。菌丝无色,有隔。粗细1.18～1.76μ m。均匀,小型分生孢子近梭形 ,两端尖,大小(4.12～5.88)×(1.18～1.76)(5.0×1.38)μ m。未产生大型分生孢子。产孢梗,基部粗,上部细,如楔形。大小(7.06～12.94)×(1.14～1.76)(9.64×1.69)μ m(图2)。(3)镰孢菌(Fusarium sp.)2属真菌界半知菌亚门,丝孢纲,丝孢目。菌落白色,大中型。菌落直径3.5～4 cm,隆起,繁茂,较致密 ,粉絮状 ,稀稠不均 ,高低不平,菌背中央紫红色,边缘白色。菌丝无色,有隔,粗1.18～4.70 μ m。菌丝上产生很多薄壁无色,球形,椭圆形膨大体,间生、顶生,一端稍膨大。未产生大孢子,仅见个别小型分生孢子(图3)。

图1 丝葚霉Papulaspora sp

图2 镰孢菌Fusarium sp.

2.2.2 秦艽 (1)镰孢菌(Fusarium sp.)3属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落中型 2～3 cm,灰色,不规则形,明显隆起,边缘放射状,羽状,菌背黑色。菌丝灰黑色 ,有隔膜,粗细 1.18～2.35 μ m,光滑,直 ,大量产生短杆状,椭圆形,小型分生孢子,单胞。大小(3.53～8.23)×(1.76～2.35)(6.17×1.91)μ m。产孢梗无色至淡灰色,菌丝结成的纠集团,未见大型分生孢子。(2)镰孢菌(Fusarium sp.)4属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落白色,稍隆起,中度致密,菌表绒状。菌背白色,边缘放射状,中部稍显淡黄至灰绿色,菌丝无色,有隔膜,粗 1.18～4.70 μ m,较直 ,菌丝上有壁薄,无色的,球形,椭圆形膨大体。根据菌落形态,菌丝膨大体基本判定为镰孢菌。

2.2.3 线叶嵩 (1)镰孢菌(Fusarium sp.)5属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落中小型,直径1.3～1.8 cm,菌表白色,稍隆起,蛛丝状,后变黄色,菌背黄色至橙黄色。菌丝无色,有隔,粗 1.18～1.76μ m。大量形成单孢,无色,短杆状,两端细的小型分生孢子,大小(3.53～8.23)×(1.18～2.35)(5.81～1.72)μ m。产孢梗单瓶梗,大小(11.76～20.0)×(1.76～2.11)(16.0×1.81)μ m。未产生大型分生孢子。(2)曲霉(Aspergillus sp.)1属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落大型,＞3.5 cm。黄绿色至暗黄绿色。稍隆起,菌表粉绒状,现轮纹。菌背灰绿色,底部有很多灰绿色小点 。菌丝无色,有隔,粗 1.76～2.94 μ m,粗细不均 ,有膨大体,分生孢子梗无色,无隔,大小(438.94～568.83)×(6.72～10.3)(516.58×8.66)μ m。稍弯曲,顶端膨大,呈球形,直径 32.93 μ m,分生孢子球形,近球形,串生,淡黄褐色,壁稍厚,大小2.35～5.88(3.79)μ m(图4)。

图3 镰孢菌2Fusarium sp.2

图4 曲霉 Aspergillus sp.

2.2.4 麻花艽 (1)镰孢菌(Fusarium sp.)6属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落白色,隆起,絮状,密厚,后期菌表有团絮状小颗粒,后部紫红色,菌丝无色,有隔,后变粗4.70～5.88 μ m。产生薄壁,椭圆形,近球形膨大体,大小不等,小型分生孢子长椭圆形,椭圆形,单孢,两端稍细,大小(7.01～9.41)×(2.94～3.53)(7.80×3.41)μ m,菌丝间生厚垣孢子。

2.2.5 珠芽蓼 (1)曲霉(Aspergillus sp.)2菌落绿色发黄,平铺,菌表粉状,稀疏。菌背米灰色,稍发绿。菌丝无色,有隔,粗 3.53～4.76 μ m。分生孢子梗(559.88～1218.29)×(6.72～14.78)(706.03×10.40)μ m。上部较粗,下部较细,顶端膨大体球形,无色,大小(22.34～37.63)×(27.05～35.28)(32.93×28.93)μ m(高宽)。分生孢子梗球形,近球形,无色至淡橄榄色,串生,壁上有小突起,内有油珠,孢子大小2.94～4.70(3.95)μ m 。

2.2.6 冷蒿 (1)曲霉(Aspergillus sp.)1同2.2.3。(2)镶孢霉(Coniatheciun sp.)1属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落灰褐色至灰黑色,平铺,大型,菌表丝绒状,菌背黑色,菌丝淡褐色。有隔,初期很细,后变褐色,粗4.70～5.88 μ m。直,菌丝上形成大小不等的串珠状厚壁孢子,壁不光滑,有小突起,大小(8.23～4.11)×(8.23～14.11)(6.17×10.75)μ m。另外,形成近球形,椭圆形,黑褐色厚壁孢子球,大小(18.82～52.92)×(18.82～32.93)(29.08×24.57)μ m(图5)。

2.2.7 狭穗针茅 (1)镰孢菌(Fusarium sp.)7属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落白色,大中型,直径3～4 cm,稍隆起,菌表粉绒状,中等繁茂,菌背米灰色,稍发紫,菌丝无色,有隔,初期较细,后变粗至 3.53 μ m,有些菌丝结成束。小型分生孢子单孢。卵圆形,椭圆形,大小(3.53～5.88)×(2.94～3.53)(4.32×3.38)μ m,量多,未见大型分生孢子。(2)丝核菌(Rhizoctonia sp.)1,菌落米白色,平铺 ,细绒状 ,大型 ＞4 cm,放射状,菌背米黄色,菌丝无色,有隔,分枝成直角,茎部缢缩,粗细 5.9～7.1(6.6)μ m,有些菌丝交织在一起。(3)曲霉(Aspergillus sp.)3属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落白色,微发黄,平铺,稀疏,稍显粉粒状,中小型2～3μ m,菌背米白色,菌丝无色,有隔,粗细 1.18 μ m。分生孢子梗963.0～1 630.4(1 280.5)μ m,顶部膨大,近球形,大小(37.63～59.98)×(32.93～49.40)(47.88×41.33)μ m,分生孢子球形,无色至淡褐色,内部有油珠,孢子大小3.53～4.70(4.20)μ m。

2.2.8 禾草 (1)黑葱花属(Periconia sp.)1属真菌界半知菌亚门,丝孢子纲。菌落黑灰色,大型＞4 cm,平铺,菌表细绒状,菌背黑色,菌丝褐色,有隔,粗 2.35～3.35 μ m,粗细均匀,硬壁厚直,隔多 ,隔处缩成椭圆形,球形,形成孢子,初无色至淡褐色,壁厚,大小 2.35～3.53(2.94)μ m。其后,孢子聚集成大小不等的球形,椭圆形孢子球,大小为 40.31～58.23 μ m,最大达277.7 μ m 。(2)曲霉(Aspergillussp.)4属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落大中型,2～4 cm,灰色发黑,稀疏,平铺,菌表粉状,菌背淡灰黑色。菌丝褐色,有隔,2.35～2.94 μ m,粗细均匀,菌丝顶端膨大成球形,大小(11.76～27.05)×(11.76～25.87)(16.46×14.01)μ m,分生孢子梗长 172.87～165.78(220.62)μ m,上部较粗 ,约 7.56 μ m,下部较细 3.53～4.70 μ m,分生孢子较小。(3)青霉(Penicillium sp.)1菌落中小型,1.5～2.0 cm,兰灰色,稍隆起,平铺,菌表粉状,菌背黄褐色。菌丝无色,有隔,粗细 1.18～2.94 μ m,扫状分枝,分枝2～5次,第 1次分枝 11.47×2.65 μ m,第 2 次分枝12.35×2.65 μ m,第 3次分枝(5.88～7.03)×1.76(6.17×1.76)μ m,分生孢子球形,无色 ,大小 2.35～3.53(2.94)μ m(图 6)。(4)青霉(Penicillium sp.)1属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落黑灰色,小型＜1 cm,稍隆起,饼状,紧密,粉状,菌背土黄色。菌丝无色,有隔 ,粗1.18～1.76 μ m,扫状分枝,顶端分枝 2 次,分生孢子球形,近球形,无色。淡橄榄色,大小2.12～2.70(2.30)μ m。

2.2.9 紫花针茅 (1)镰孢菌(Fusarium sp.)8属真菌界半知菌亚门,丝孢纲。菌落白色,繁茂,隆起,较疏松,粗絮状,菌背土黄色,菌丝无色至淡黄色,有隔,1.18～4.7 μ m,较直,小型分生孢子短杆状 ,单孢,无色,直或稍弯曲,大小(7.06～14.11)×(1.18～3.53)(10.4×1.47)μ m,未见大型分生孢子。

图5 镶孢霉(Fusarium sp.)

图6 青霉1(Penicillium sp.)

3 讨论

(1)分离的9种植物根部共发现真菌7属,其中,镰孢菌为优势属种,曲霉属次之,而其他几种真菌均未鉴定到种,韩玉竹[18]认为可能是3点原因,首先,时间因素。其次,不产孢是阻碍鉴定的因素。此外,我国高寒草地的研究较少,缺乏相关的资料和工具书。9种植物中草地早熟禾入侵真菌较多,而麻花艽和紫花针茅上都仅有1种,这与根部有机质及植物本身有关。

(2)对植物组织分离法获得的真菌进行了鉴定,会出现由于消毒不彻底而分离到根表的一些真菌。因此,需要进行回接试验,最终确定真正的入侵真菌。

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