不同豆科牧草总皂苷含量的测定

沈 静,吕文坤,曹致中

(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心,甘肃兰州 730070)

紫花苜蓿、新疆大叶苜蓿、白花苜蓿为豆科苜蓿属植物,其中紫花苜蓿,新疆大叶苜蓿营养物质含量非常高,常作为饲料而被广泛种植,多分布于我国长江以北的广大地区,西起新疆,东到江苏北部的14个省市自治区,主产区在黄河流域的华北、西北地区。在我国20世纪90年代初苜蓿种植面积约有133万hm2,居世界第6位[1]。近年来随着农业结构的调整,面积有所增加,现在栽培面积约188万hm2[2]。白花苜蓿是育种工作者从大田中挑选出的开白花的苜蓿品系。小冠花又名多变小冠花,是豆科小冠花属多年生草本植物,原产于南欧和地中海一带,在加拿大和美国种植较多,近年来才引入我国,具有抗旱、抗涝、抗病虫害、耐贫瘠等优良的抗逆性[3,4]。红豆草又称驴食豆和圣车轴草,原产于欧洲,是豆科红豆草属多年生草本植物,在我国许多地方有引种,栽培效果良好。红豆草具有较强的抗旱、抗寒能力,一次种植可利用4～6年[5]。紫云英又称红花草,广泛分布于N 24°～35°地区,喜温暖湿润条件,有一定耐寒能力,养分含量和饲料价值较高[6]。百脉根是豆科百脉根属多年生草本植物,原产于欧亚两洲温带,19世纪后期开始栽培。性喜温暖湿润气候,耐寒、抗旱、耐瘠薄,我国多个地方均有野生种分布,在引种方面做了大量的试验,但都未在生产中推广应用[7]。目前,豆科植物的利用主要集中于青饲和干草加工,对生物活性的研究很少,其药用功能尚未被很好的开发利用。

上述几种豆科牧草在我国传统医药中具有重要的作用,在民间作为传统草药已有千余年的历史。《中药大辞典》记载其主要功能为:“清脾胃,利大小肠,下膀胱结[8]。”陶弘景著《名医别录》将苜蓿列为菜之上品[9]。《本草衍义》记载苜蓿“利大小肠”[10];《本草纲目》谓其有“利五脏,轻身健人”之功效[11]。研究表明苜蓿能防止动物的高胆固醇血症和动脉粥样硬化的形成,也能降低实验动物的高胆固醇血症,并引起粥样化板块的消失,这种作用被认为是由其中的苜蓿皂苷引起的[12],其他几种豆科牧草在次生代谢方面的研究报道比较少。因此,将以上豆科植物作为原料来研究开发降血脂及其他生物活性方面的药物具有很广阔的前景。

几种豆科植物所含的皂苷为齐墩果烷型或常春藤型三萜皂苷,两者结构很相似[13-19],与香草醛-冰醋酸显色剂反映均呈紫红色,齐墩果酸为齐墩果烷型或常春藤型三萜皂苷的苷元或类似物,故选择易得的齐墩果酸为对照品。文献报道中齐墩果烷型皂苷多用5%香草醛-冰醋酸显色,显色液呈紫色,显色液在550 nm处有最大吸收值,用分光光度法测定[8]。试验采用不同豆科牧草为材料,利用分光光度法测定比较了总皂苷的含量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 紫外可见分光光度计(UNICO UV-2000,上海欣茂仪器有限公司出品),数控超声波清洗器(KQ2250DE,昆山市超声仪器有限公司出品),电热恒温水浴锅(KE-WeI,北京科伟永鑫实验仪器厂),旋转蒸发仪(RE-52,上海亚荣生化仪器厂),电热板(浙江省嘉兴县新胜电器厂),精密电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),台式高速冷冻离心机(德国制造)。

1.1.2 试剂 齐墩果酸标准品(HPLC≥98%,购自上海源叶生物科技有限公司)、高氯酸、香草醛、甲醇(天津市光复精细化工研究所),正丁醇、乙酸乙酯(天津市光复科技发展有限公司),冰醋酸(天津市大茂化学试剂厂),丙酮(天津化学试剂有限公司),以上试剂均为分析纯。

1.1.3 试样 甘农三号紫花苜蓿(Medicago sativa cv.Gannong No.3)、新疆大叶苜蓿(Medicago sativa cv.Xinjiang Daye)、白花苜蓿(Medicaqo sativa cv.Baihua)的茎、叶、花及全株;小冠花(Coronilla varia)、鹰嘴紫云英(Astragalus sinicus)、红豆草(Onobrychis vicii folia)、百脉根(Lotuscorniculatus)的全株。以上材料均采自甘肃农业大学草业学院景泰试验基地,在盛花期选择生长势一致、健康无病的3种苜蓿植株分茎、叶、花及全株刈割,其余牧草收割全株,室内荫干后粉碎,过60目筛,备用。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液的配制 精密称取在105℃干燥至恒重的标准品齐墩果酸5.0 mg,用甲醇定容于50 mL的容量瓶,摇匀,得到浓度为10 mg/100 mL的齐墩果酸甲醇溶液,备用。

1.2.2 供试样品总皂苷的提取和溶液的配制 精确称取同一批材料过60目筛的样品粉末1.000 0 g,于100 mL的小烧杯中加入50 mL水煮1.5 h,每个样品3次重复,真空抽滤并加开水洗涤至流出液无色为止,水提液加正丁醇萃取,后放入旋转蒸发仪中回收正丁醇,所得浓缩液放入烧杯中加丙酮沉淀,离心除去上清夜,洗涤沉淀,沉淀在80℃挥干水分。最后用甲醇溶解沉淀,将溶解液转移到100 mL的容量瓶中,剩余在小烧杯中的液体继续加甲醇溶解,将所有溶解液都转移入容量瓶中,并用甲醇定容至100 mL,摇匀后转移入小烧杯中备用。

1.2.3 标准曲线的绘制 精密吸取 0.000 0、0.300 0 、0.400 0 、0.500 0 、0.600 0 、0.700 0 、0.800 0 mL齐墩果酸标准品溶液于具塞试管中,水浴蒸干溶剂,加入新配5%香草醛-冰醋酸溶液0.20 mL,高氯酸0.80 mL密塞,摇匀后于70℃恒温水浴锅中加热15 min,取出后立即用流水冷却,加乙酸乙酯5.00 mL摇匀,反应混合物供测试用[8]。以没加标准品随行液做空白对照,于550 nm测其吸光度(A),以浓度(x,mg/100 mL)为横坐标,吸光度为纵坐标,做标准曲线(图1)。经回归处理,得回归方程:y=0.081 8x-0.038 1,R2=0.999 0。结果表明齐墩果酸在1～10 mg/100 mL线性关系良好。

1.2.4 精密度试验 精密移取齐墩果酸对照样品溶液0.2 mL于具塞试管中,重复7次水浴蒸干溶剂,按上述1.2.3显色条件显色,流水冷却至室温,550 nm处测定吸光度。其中RSD=1.62%,结果表明,试验仪器精密度良好。

1.2.5 稳定性试验 精密量取齐墩果酸标准溶液0.20 mL,其余按1.2.4步骤操作,配制反应液,以实际空白做对照,在550 nm处测定吸光值。每10 min测定1次,在60 min内样品的吸光值见图2。由图可以看出,随时间延长吸光值逐渐降低,但在60 min内变化不明显,故此样品稳定性较好。

1.2.6 样品的测定 精密量取供试样品溶液0.2 mL于具塞试管,每个样品3个重复,以试样空白作参照,按上述1.2.3中方法操作,测得吸收值。计算供试样品总皂苷含量。总皂苷含量的计算公式:总皂苷含量(mg/g)=(C×V)/W。其中C为提取液总皂苷的浓度(mg/100 mL);V为提取液体积(100 mL);W为样品质量1.000 0 g。

图1 齐墩果酸对照品标准曲线Fig.1 Standard curve of oleanolic acid standard

图2 稳定性试验曲线Fig.2 The absorbance curve under different time

3 结果与分析

供试苜蓿均为花中的总皂苷含量最高,叶居中,茎中的含量最低。新疆大叶苜蓿茎、叶、花中总皂苷的含量分别为2.798,4.471和6.519 mg/g;甘农三号紫花苜蓿茎、叶、花中的总皂苷含量分别为3.092,5.688和9.757 mg/g;白花苜蓿茎、叶、花中的总皂苷含量分别为3.331,4.270和8.231 mg/g(表 1)。

不同豆科牧草总皂苷含量不同,其中小冠花中含量最高,百脉根中含量最低(表2)。其中总皂苷含量由高到低的顺序依次为:小冠花5.928 mg/g、甘农三号紫花苜蓿5.419 mg/g、鹰嘴紫云英 5.018 mg/g、白花苜蓿4.558 mg/g、红豆草4.197 mg/g、新疆大叶苜蓿4.000 mg/g、百脉根3.189 mg/g。各豆科牧草总皂苷含量差异极显著(表3)。

表1 苜蓿不同部位总皂苷含量Table 1 The total saponins in different parts of different Alfalfa

表2 豆科牧草全株总皂苷含量Table 2 The total saponins in different Legumes

表3 豆科牧草总皂苷含量Table 3 Variance analysis of the total saponins content in different leguminous forage

试验方法与结果表明:此实验方法准确、简便、易行,试验过程中的有机溶剂均可回收利用,在工厂化生产中既节省成本又对环境未造成污染。2种苜蓿品种和1个苜蓿品系花中的总皂苷含量最高,叶居中,茎的含量最低。不同种豆科牧草总皂苷含量的差异极显著,其中小冠花总皂苷含最高,而百脉根含量最低。供试豆科牧草总皂苷含量由高到低顺序依次为:小冠花5.268 mg/g、甘农三号紫花苜蓿4.715 mg/g、鹰嘴紫云英 4.273 mg/g、白花苜蓿 3.694 mg/g、红豆草3.398 mg/g、新疆大叶苜蓿3.183 mg/g、百脉根2.304 mg/g。在工厂化生产时首先选择资源丰富且总皂苷含量高的豆科植物,但同时也需注意就地取材,以便节省成本,获得更大的经济效益。

4 讨论

豆科牧草含有多种皂苷成分,具有溶血活性及解毒、增强免疫力[8];抗霉菌、真菌作用[11];降血脂、抗癌[16]等,这些作用是多种皂苷共同作用的结果。国内外报道生物中总皂苷含量的测定方法包括生物测定和化学测定,在生物测定的方法中,早期使用最多的是利用皂苷有溶血作用的特征,以溶血指数来计算皂苷含量等方法[20,21]。但这些方法均存在一定的缺陷。化学方法测定植物皂苷的最基本方法主要有比色法[14]和薄层法(T LC)[15]。近年来随着对植物中皂苷种类、结构的了解,HPLC[15]等方法也被用于植物中总皂苷含量的测定,这类方法可以准确测定单体皂苷的含量,但需要仪器设备的支持。试验根据实验室条件选择比色法测定,选择齐墩果酸为对照品在550 nm处测定吸光值。通过标准曲线确定了几种豆科植物中总皂苷的含量,并获得了良好的线性关系,该方法准确、简便、易行。

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