一氧化氮在三氧化二砷抑制马立克病病鸡肾脏肿瘤生长中的作用

李金龙,国 琳,刘晓瑛,张久丽,3,孙 刚,徐世文

(1.东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030;2.浙江省余姚市畜牧兽医局,浙江余姚315400;3.黑龙江畜牧兽医职业学院,黑龙江双城150100;4.黑龙江省动物卫生监督所,黑龙江哈尔滨150008)

三氧化二砷(As2O3)是中药砒霜的主要成分,我国学者应用As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病取得良好的疗效,从而为肿瘤的治疗提供了一个新思路。鸡马立克病(MD)是由疱疹病毒属马立克病病毒引起的一种鸡的恶性淋巴肿瘤性疾病,由于MD病鸡的许多特性与哺乳动物肿瘤的发生有相似之处,而被作为研究肿瘤性疾病的良好模型[1]。一氧化氮(NO)作为重要的生物介质在肿瘤发生、发展和死亡中的作用,已成为肿瘤研究及治疗的热点。目前已有一些关于As2O3诱导体外培养MD肿瘤细胞株凋亡的研究[2-3],但关于NO代谢在其抑制鸡肾脏肿瘤生长的研究未见报道。本文旨在探讨NO代谢在As2O3抑制鸡马立克病病鸡肾脏肿瘤生成的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 As2O3注射液(1mg/mL)由本研究室制备。rTaq DNA聚合酶购自大连TaKaRa公司,NO与一氧化氮合酶(NOS)分型试剂盒购自南京建成生物工程研究所;T rizol与M-MLV等试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2 试验动物与处理 试验动物处理参见文献

[4],分别于第35、40、45天断头处死,观察病理解剖学变化,快速取试验组肿瘤组织和对照组肾脏组织,按常规法固定、制片、H.E.染色 。

1.3 鸡肾脏及肿瘤组织中NO含量及NOS活性的检测 NO含量的测定采用硝酸还原酶法,总NOS(T-NOS)、诱导型 NOS(iNOS)与构建型 NOS(cNOS)活性的测定采用化学比色法,具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4 鸡肾脏及肿瘤组织中iNOS mRNA表达水平的检测 根据GenBank上iNOS基因序列(序列号U34045)与β-actin基因序列(序列号 NM205518),应用Oligo6.0软件设计引物,由上海英骏生物技术有限公司合成。iNOS引物(PCR产物长度500bp)上游:5′-TTGTGCAT TGAGCTTGGGT-3′,下游 :5′-CCTCGCACACGGTACTCATT-3′;β-actin 引物(PCR产物长度282bp)上游:5′-ACGTCGCACTGGATT TCGAG-3′,下 游 :5′-TGTCAGCAATGCCAGGGTAC-3′

应用Trizol试剂盒提取肾脏及肿瘤组织总RNA,并测定 RNA浓度及纯度。取总 RNA 5.0 μ g,以加寡脱氧胸苷(Oligo(dT))为引物进行反转录反应。取反转录产物2 μ L,进行 50 μ L 反应体系PCR扩增。扩增条件为:预变性95℃5 min,变性95℃1 min,退火 54.5℃(iNOS)、54℃(β-actin)、45 s,延伸 72℃1 min,30个循环,72℃终延伸 7 min。分别以iNOS基因与β-actin基因的PCR产物的灰度比值来表示基因mRNA的相对表达水平。1.5 试验数据的分析与统计 数据的统计学分析应用SAS软件与Microsoft Excel 2000对试验数据进行统计并作图。

2 结果

2.1 临床症状观察及病理学变化 对照组鸡无异常。攻毒组鸡表现出MD典型症状,如“劈叉”现象,剖检可见肾脏表面有灰白色粟粒至绿豆大不等的病灶。攻毒组加砷组鸡注射As2O3后,随着时间的延长症状逐渐减轻,剖检可见肾脏肿瘤出现明显减少,生成的肿瘤也有明显减小。病理组织学检查可见对照组肾脏结构正常。攻毒组病鸡肾脏肿瘤组织由淋巴瘤细胞组成,瘤细胞大小不一致,有的可见核分裂相,核染色质边集,核呈空泡,双核仁,细胞浆不清。攻毒组加砷组病鸡肾脏组织瘤细胞浸润到肾小球之间,肾小球入球动脉管壁增厚,管腔变窄,肿瘤细胞有核崩解、核溶解现象。

2.2 鸡肾脏及肿瘤组织中NO含量及NOS活性的检测结果

2.2.1 鸡肾脏及肿瘤组织中NO含量的检测结果由表1可知,攻毒加砷组肾脏肿瘤组织中NO含量随时间的延长逐渐降低,与同一时间段对照组比较,35 d组与40 d组间差异极显著(P＜0.01);与同一时间段攻毒组比较,40 d组与45 d组差异极显著(P＜0.01);攻毒加砷组间比较,35 d组与40 d组和45 d组间差异极显著(P＜0.01)。

表1 鸡肾脏及肿瘤组织内N O含量的检测结果(μ mol/mg prot)

2.2.2 鸡肾脏及肿瘤组织中NOS活性的检测结果 由表2可以看出,各攻毒加砷组肾脏肿瘤组织中T-NOS、iNOS及cNOS活性均随时间的延长逐渐降低。攻毒加砷组肾脏肿瘤组织中NOS活性与同一时间段对照组间及攻毒组间差异比较均显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。

表2 鸡肾脏及肿瘤组织中NOS活性的检测结果 (U/mg prot)

2.3 鸡肾脏及肿瘤组织中iNOS mRNA表达水平的检测结果 由表3及图1可知,攻毒加砷组肾脏肿瘤组织中iNOS mRNA的表达水平随时间的延长逐渐降低,与同一时间段对照组相比,35 d组和40 d组差异极显著(P＜0.01);与同一时间段攻毒组相比,各组均差异极显著(P＜0.01);攻毒加砷组间比较,各组均差异极显著(P＜0.01)。

表3 鸡肾脏及肿瘤组织内iNOS mRNA表达水平的检测结果[IOD(iNOS)/IOD(β-actin)]

3 讨论

图1 As2O3对鸡肾脏及肿瘤组织中iNOS mRNA表达的影响

体外研究表明,As2O3能够抑制鸡MD肿瘤细胞株 MDCC-MSB1细胞的增殖,并诱导 MDCCMSB1细胞发生凋亡[2-3]。新近发现NO是一种血管形成调节因子,与肿瘤的生长有一定关系[5]。肿瘤组织可通过自分泌细胞因子诱导iNOS的产生,从而调节NO的合成[6]。NO可诱导内皮的分裂、增生,调节肿瘤血管新生,调控肿瘤血流量[7]。肿瘤细胞的高生长率有赖于NO的生成[8],没有NO生成肿瘤的生长将会因血供的缺乏而受到限制[9]。然而,NO在As2O3发挥作用时也起着重要作用,刘莹等[10]研究表明,As2O3可引起肿瘤细胞和肿瘤组织NO生成的减少,进而抑制肿瘤生长。ChouY等[11]研究表明,100 ng/mL的As2O3能够在1h后使人主动脉内皮细胞内NO含量降低,48h后使eNOS活性降低,而As2O3对SD大鼠体内的NO含量与eNOS活性保持不变。Dulak J等[12]研究显示,NO可能在促进肿瘤血管的生成中发挥重要作用。

本试验结果显示,马立克病病鸡注射As2O3后病鸡症状减轻,病理变化变少,特别是肾脏肿瘤改变明显,表明As2O3能够一定程度上抑制肾脏肿瘤生成。揭示MD诱发的肾脏肿瘤组织中NOS活性加强,可以增加iNOS的表达,进而调节NO的合成,NO可促使内皮细胞的分裂、增生,调节肿瘤血管新生,促进肿瘤的生长,而As2O3能够通过降低肿瘤组织中NOS活性,抑制iNOS的表达,降低NO含量,从而发挥抑制肿瘤生长和侵袭的目的,揭示NO在As2O3抑制马立克病鸡肾脏肿瘤生长过程中发挥着重要作用。

[1]Burgess S C,Basaran B H,Davison T F.Resistance to Mare k's disease herpesvirus-induced lymphoma is multiphasic and dependent on host genotype[J].Vet Pathol,2001,38:129-142.

[2]张久丽,王金涛,肖银霞,等.三氧化二砷诱导鸡 MD肿瘤细胞凋亡及对细胞内钙离子浓度的影响[J].中国家禽,2008,30(10):21-24.

[3]张久丽,李忠显,吴立君,等.三氧化二砷对鸡马立克氏病肿瘤细胞凋亡的影响[J].中国兽医科学,2008,38(2):137-141.

[4]李金龙,国琳,刘晓瑛,等.一氧化氮在A s2O3抑制马立克氏病鸡肝脏肿瘤生长中的作用[J].中国兽医科学,2010,40(1):65-69.

[5]曾毅力,潘敬新.一氧化氮与肿瘤的多重关系[J].医学综述,2009,15(11):1644-1646.

[6]朱祖安,刘莹,费素娟.iNOS在胃癌中的表达及其与微血管密度的关系[J].徐州医学院学报,2005,25(1):3-6.

[7]刘俊林,李汉贤.一氧化氮与肿瘤[J].医学综述,2007,13(9):667-669.

[8]Jenkins D C,Charles IG,Thomsen L L,et al.Roles of nitric oxide in tumor growth[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(10):4392-4396.

[9]Brown J M.S R 4233(tirapazamine):a new anticancer drug exploitinghy poxia in solid tumours[J].Br J Cancer,1993,67(6):1163-1170.

[10]刘莹,柳红,孔庆兖.SOD和NOS、NO在As2O3抗S180肉瘤细胞中的作用[J].徐州医学院学报,2005,25(1):8-12.

[11]Chou Y,T sai C H,Ueng K C,et al.Endothelial gap junctions are down-regulated by arsenic trioxide[J].Eur J Pharmacol,2007,569(1-2):29-36.

[12]Dulak J,Józkowicz A,Dembinska-Kiec A,et al.Nitric oxide induced the synthesis of vascular endothelial growth factor by rat vascularsmooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(3):659-666.