微柱凝胶免疫法检测人血中美洛西林针剂的IgM和IgG抗体

林观样，潘晓锋，郭 红，林聪丽

（温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000）

美洛西林针剂中含有半抗原性质的化学成分，这些组分进入血液后可刺激机体产生相应的抗体，习惯上称为美洛西林抗体。长期以来，国内外对美洛西林IgE抗体关注较多，而对美洛西林IgM和IgG抗体缺乏足够重视。一方面，临床上有些药害事件与这些抗体密切相关；另一方面，临床上又缺乏检测IgM和IgG抗体的实用技术，给评估用药人群中美洛西林的免疫状况带来困难。为此，笔者参考相关文献[1-2]，尝试用微柱凝胶免疫法测定美洛西林钠的IgM和IgG抗体，现报道如下。

1 仪器与试药

LISS/Coombs/IgG+C3d微柱凝胶卡（瑞士DiaMed公司，批号为50531.25.55）；卡式定速离心机（瑞士达亚美公司）；37℃恒温孵育器（瑞士达亚美公司）。注射用美洛西林钠（山东瑞阳制药有限公司，批号为05101401）；pH为9.6的巴比妥缓冲液（自制）；O型血液（采自健康献血者，肝素抗凝，冷藏备用）；待检血液（采自住院患者和健康献血者，肝素抗凝，冷藏备用）。

2 方法与结果

2.1 样品制备

等份吸取20名O型血健康献血者新鲜血液，混匀后取10 mL压积红细胞，置试管中，加90 mL生理盐水，混匀，在2 000 r/min转速下离心2 min，弃去上清液，用生理盐水洗涤红细胞3次，即成不含药物的空白O型人红细胞，备用。将1 g美洛西林钠注射剂溶于pH为9.6的巴比妥缓冲液60 mL中，加入4 mL空白O型人红细胞，室温孵育1 h，用生理盐水洗涤红细胞3次，即成美洛西林化红细胞。用适量生理盐水配成2%红细胞悬液，备用。按上述操作方法，用生理盐水代替美洛西林钠注射剂制成2%空白红细胞悬液，作为阴性对照液，备用。将待检血液在2 000 r/min转速下离心2 min，取上清液即为待检血清。吸取待检血清适量，置56℃恒温水浴箱中，保温30 min灭活血清中的补体，作为补体灭活的血清对照组。

2.2 检测方法

分别取2%美洛西林化红细胞悬液40 μL置微柱凝胶柱上，加100 μL的待检血清置37℃恒温孵育器中，孵育20 min，置卡式定速离心机中以1 030 r/min的速度离心10 min，观察凝集现象。同时，分别用2%空白红细胞悬液及生理盐水代替美洛西林化红细胞悬液作对照，其余操作相同，记录结果，考察抗原制备情况。另外，分别用补体灭活的血清及生理盐水代替待检血清，依次用美洛西林化红细胞、空白红细胞和生理盐水测试，其余操作相同，记录凝集结果，考察补体对本检测方法的干扰情况。所有的凝集试验都做2次。

2.3 阳性结果判定标准

离心后，红细胞群完全沉积于凝胶柱底部者为阴性，停留于凝胶柱上部者为阳性，分布于凝胶柱中间者为弱阳性。微柱凝胶免疫结果见图1。

图1 微柱凝胶免疫结果图

2.4 重复性试验结果

76份待检血清经2次平行检测，判定为阳性7份，弱阳性2份，阴性67份。2次检测结果中阳性、阴性比例完全一致，表现为阳性、阴性的血液标本号完全相同。2份弱阳性系红细胞群在凝胶柱中的位置有点变化，经第3次重复试验，结果还是弱阳性，因此计为阳性。

2.5 干扰试验结果

待检血清、补体灭活血清和生理盐水对非美洛西林化红细胞都表现为阴性，提示两种血清对上述方法制备的多人混合的健康献血者O型人红细胞均无凝集反应。待检血清、补体灭活血清和生理盐水对美洛西林化红细胞的凝集结果一致，表现为阳性、阴性的血液标本号完全相同（见表1），说明待检血清中的补体及其他组分对阳性反应的结果没有干扰。结合阴性对照组的结果，可确定阳性血清具有美洛西林钠针剂抗原反应特性。

表1 76份血样检测结果中阳性结果的样品号

2.6 样品检测结果

样品1至50号为住院患者的血液标本，51至76号为健康献血员的血液标本。在阳性血液中，有3例住院患者正在使用美洛西林钠针剂，1例正在使用头孢硫脒针剂，1例正在使用左氧氟沙星针剂，3例未使用过抗生素，还有1例为用药史不详的健康献血者。在阴性血液中，有7例住院患者正在使用美洛西林钠针剂，8例正在使用其他β-内酰胺类抗生素。

3 讨论

当美洛西林针剂中的半抗原物质被红细胞吸附后成为全抗原，这种抗原颗粒可被相应抗体桥连形成较大的团块，在微柱凝胶中非特异性IgG作用下变成更大的团块，以致不能通过凝胶柱中微小孔隙，从而停留于凝胶柱上端，表现为阳性结果。相反，被检血清中如果没有相应的抗体，红细胞就会在离心力的作用下穿过凝胶柱，从而沉积于凝胶柱底部，表现为阴性结果。当药敏化的红细胞和相应抗体不是以最佳比例结合时，团块可分布在凝胶柱中间，呈现弱阳性。本试验中，有几根凝胶柱出现上部和下部都有红细胞群的现象。这可能是因为所用空白红细胞来自多份血液，有些来源的红细胞不易被美洛西林钠针剂中半抗原物质致敏，因此不能与待检血液中的相关抗体有效结合，最终在离心力作用下沉于凝胶底部。相反，另一部分被较好致敏的红细胞则停留在凝胶柱上部。但也不排除是待检血液中相应抗体滴度差别所致。

美洛西林皮肤过敏试验主要是检测美洛西林IgE抗体，但美洛西林IgE抗体反应阴性时，美洛西林IgM和（或）IgG仍可能是阳性。本研究的结果也证明了这一点，在接受美洛西林治疗的10例患者中（皮肤过敏试验均阴性），有3例呈IgM和（或）IgG抗体阳性。因此有必要在美洛西林皮肤过敏试验的基础上增加人血清美洛西林IgM和（或）IgG抗体的筛查。微柱凝胶免疫法方法简便、结果稳定，可操作性强，适用于临床检验工作。

[1]谢作听，钱林利，陶志华，等.血清青霉素IgM和IgG抗体检测方法的建立及评价[J]. 中华检验医学杂志，2006，29（6）：527-528.

[2]浑守勇，刘明霞，王玉芝.微柱凝胶技术在红细胞不规则抗体筛选中的应用[J]. 现代检验医学杂志，2006，21（1）：37-38.