siRNA沉默survivin基因表达对恶性胶质瘤细胞放射敏感性的影响

张瞳光，杜利力，刘显明，王厚中，于晓丽

（1.山东省青岛市立医院神经外科，山东 青岛 266001； 2.山东省青岛市商业医院肿瘤内科，山东 青岛 266071）

恶性胶质瘤是成人最常见的原发性恶性脑肿瘤，通常迅速导致患者死亡[1]，其治疗方案仍局限于手术治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗及其联合治疗。放射治疗是目前恶性胶质瘤重要而有效的临床治疗手段之一，但副作用和并发症限制了其临床应用。因此，增加肿瘤细胞辐射敏感性，减少放射治疗的副作用和并发症具有重要的临床意义。目前基因治疗已经成为提高肿瘤放疗敏感性的重要手段，具有广泛的潜在临床应用价值[2]。Survivin是新近发现的一个肿瘤特异性凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白家族（inhibition of apoptosis proteins，IAPs）中作用最强的分子，具有抑制细胞凋亡和调节细胞周期的双重功能，与恶性胶质瘤的发生、发展及预后密切相关[3-4]。已有文献表明，survivin基因的高表达水平与恶性胶质瘤的放疗抗性密切相关[5]。因此，抑制survivin基因表达有可能提高恶性胶质瘤细胞放疗敏感性。笔者拟采用RNA干涉（RNAi）技术抑制survivin基因表达，观察恶性胶质瘤细胞放疗敏感性的变化，为临床恶性胶质瘤的治疗方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

恶性胶质瘤细胞株（U251）购自中国科学院上海细胞研究所，在含10%胎牛血清的1640培养基及37℃，5%CO2孵箱中培养。大肠杆菌JM109菌种为本室保存；DMEM培养基、TRIZOL试剂、脂质体LipofectamineTM2000和G418及T4 DNA连接酶均购自Invitrogen公司；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；兔抗人survivin单抗、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG购自Santa cruz公司；RNA干涉载体pSilencer 4.0-CMV neo购自美国Ambion公司。DNA合成与测序由北京奥科生物技术有限工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 siRNA片断的设计及合成

根据人survivin编码区cDNA的序列（GenBank NM U75285）和载体设计的具体要求，shsurvivin 1：sense 5′-GATCCGAATTAACCCTTGGTGAATTTCAAGACGATTCACCAAGGGTTAATTCTTTTTTGAATTCA-3′；shsurvivin 2：sense 5′-GATCCGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGACGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTGAATTCA-3′；片断两端有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，由北京奥科生物技术有限工程公司合成。

1.2.2 干涉载体的构建及鉴定

取 10 μL 重组质粒，10 ×K buffer 5 μL，HindⅢ和 BamHⅠ限制性内切核酸酶各1 μL，用无核酶三蒸水补足50 μL，37℃双酶切6 h。酶切产物10 μL，2%琼脂糖电泳。然后将细菌培养扩增，过夜培养细菌（摇至对数期），加无菌甘油，送北京奥科生物技术有限工程公司测序部，阳性克隆命名为pSil 4.1-shsurvivin 1，pSil4.1-shsurvivin 2 和 pSil 4.1-shcontrol（NC，non-specific shRNA，由美国Ambion公司提供）。

1.2.3 质粒转染及细胞筛选

将恶性胶质瘤细胞（U251）1.5×105/孔接种于6孔板，24 h后覆盖率达60%～70%时进行细胞转染。按照脂质体LipofectamineTM2000说明书方法进行细胞转染。转染48 h后以800 μg/mL的G418筛选14 d，再以200 μg/mL的G418维持筛选，扩增细胞。稳定转染的细胞分别命名为U251-s1，U251-s2和U251-NC。

1.2.4 RT-PCR检测survivin mRNA表达

收集未转染的或稳定的转染细胞系（U251，U251-NC，U251-s1，U251-s2）。采用 TRIzol法提取细胞的总 RNA，操作步骤按说明书进行，然后取总RNA 2 μg进行反转录。survivin引物：上游引物为 5′-CAAGGACCACCGCATCTC-3′，下游引物为 5′-TCTCCGCAGTTTCCTCAA-3′（347 bp）。β -actin（内参）：上游引物为 5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，下游引物为 5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′（594 bp）。产物经2%琼脂糖电泳检测。按公式分别计算细胞中suvivin mRNA表达的抑制率：抑制率=（1-U251-s2 survivin mRNA光密度值/U251-s2 β-actin mRNA光密度值）/（U251 survivin mRNA光密度值/U251-s2 β-actin mRNA光密度值）×100%。

1.2.5 Western blot检测survivin蛋白表达

收集未转染的或稳定的转染细胞系（U251，U251-NC，U251-s1，U251-s2）。提取细胞总蛋白，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，10%脱脂奶粉封闭 1 h，一抗为 1∶500稀释的 survivin和 β-actin（Santa cruz公司），二抗为辣根过氧化物酶标记的1∶1000稀释的IgG。PVDF膜依次与抗体作用后与免疫印迹化学发光试剂（ECL）反应。X线片曝光、显影、定影后分析表达情况。按公式分别计算细胞中suvivin蛋白表达的抑制率：抑制率=（1-U251-s2 survivin蛋白光密度值/U251-s2 β-actin蛋白光密度值）/（U251 survivin蛋白光密度值/U251-s2 β-actin蛋白光密度值）×100%。

1.2.6 体外克隆形成试验

收集未转染的或稳定的转染细胞系（U251，U251-NC，U251-s2）。按每皿1.0×104接种于60 mm的培养皿中，并继续培养24 h。均采用西门子直线加速器MD7745（德国西门子公司生产）对细胞进行室温下放射照射，剂量分别为 0，2，4，6，8 Gy。照射 24 h 后更换新的培养基。连续培养14 d后，酒精固定，再进行吉姆萨染色。细胞克隆计数并计算克隆形成率。

1.2.7 动物试验

用100 μL的PBS稀释1.0×107个未转染或稳定转染的细胞系（U251，U251-NC，U251-s2），分别注射于 8 周龄裸鼠皮下（雌雄各半，每组8只）。待皮下移植瘤直径达7～8 mm左右时，采用西门子直线加速器MD7745分别给予放射照射治疗3次，照射剂量为6.0 Gy。每隔3 d测量皮下瘤体积1次，按公式 V=0.4×长轴×短轴的平方计算体积。28 d后处死动物并测量皮下移植瘤体积。肿瘤体积抑制率=（1-U251-s2组平均皮下瘤体积/U251平均皮下瘤体积）×100%。

1.2.8 统计学处理

数据统计采用SPSS 13.0软件。多组别样本均数之间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 重组质粒的酶切鉴定及测序

重组质粒经双酶切后电泳结果证明，pSil 4.1-shsurvivin 1和pSil 4.1-shsurvivin 2真核表达载体构建正确，并且测序结果与所设计siRNA寡核苷酸链序列一致，表明重组干涉载体构建成功。

2.2 siRNA对survivin mRNA表达水平的作用

RT-PCR检测siRNA对survivin mRNA表达水平的作用如图1所示：相对于未转染的U251细胞和阴性对照组U251-NC细胞（稳定转染 pSil 4.1-NC载体），U251-s2细胞（稳定转染pSil 4.1-shsurvivin 2载体）的survivin mRNA表达水平降低了约40.5%（P＜0.05），而U251-s1细胞 （稳定转染pSil4.1-shsurvivin1载体）的survivin mRNA表达水平则没有明显变化（P＞0.05）。

图1 RT-PCR检测survivin mRNA结果

2.3 siRNA对survivin蛋白表达水平的作用

Western blot检测siRNA对survivin蛋白表达水平的作用如图2所示：相对于未转染的U251细胞和阴性对照组U251-NC细胞，U251-s2细胞的survivin蛋白表达水平降低了约51.8%（P＜0.05），而U251-s1细胞的survivin蛋白表达水平则没有明显变化（P＞0.05）。鉴于pSil 4.1-shsurvivin 2对survivin基因表达显著的干涉作用，选择U251-s2细胞进行后面的试验。

图2 Western blot检测survivin蛋白结果

2.4 shsurvivin 2对U251细胞体外放射敏感性的影响

为了检测survivin基因下调后对恶性胶质瘤细胞（U251）体外放射敏感性的影响，进行了体外克隆形成试验。结果如图3所示：经照射后各组细胞生存率随着放射剂量变化逐渐降低，U251和U251-NC细胞之间的克隆形成率无明显差别（P＞0.05），而射线照射 4，6，8，10 Gy 时，U251-s2细胞的克隆形成率较另两组细胞明显降低（P＜0.05）。

2.5 shsurvivin 2对U251细胞体内放射敏感性的影响

图3 细胞生存率变化

为了检测survivin基因下调后对恶性胶质瘤细胞（U251）体内放射敏感性的影响，进行了皮下移植瘤试验。结果如图4所示：相对于对照组动物，U251-s2细胞皮下移植瘤动物组的瘤体积随着时间变化抑制率逐渐增加，待28 d时抑制率达最大，为55.2%。

3 讨论

Survivin是1997年Altieri等在人类基因组库的杂交筛选中首先分离并克隆出来的凋亡蛋白抑制因子（IAP）家族中的一个重要成员，全长14.7 kb，有4个外显子和3个内含子[6]。Survivin基因编码的蛋白质含有142个氨基酸，相对分子质量为16 200，仅含有单一的杆状病毒IAP重复序列（baculovirus IAP repeat，BIR）功能区，通过抑制蛋白酶级联反应过程中位于下游的caspase-3和caspase-7的活性，发挥凋亡抑制作用[7]。Survivin蛋白的生物学功能主要体现抑制细胞凋亡、参与细胞周期调控、促进细胞增殖、促进细胞有丝分裂、促进血管增生等方面，因此被认为是肿瘤发生发展过程中发挥重要作用的一个关键分子[8]。Survivin基因在多种恶性肿瘤包括胃癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等的肿瘤组织中呈现高表达状态，而在这些肿瘤组织相对应的正常组织中并不表达survivin[9-12]。同时多篇文献还报道，survivin基因的高表达与肿瘤细胞的化疗抗性和放疗抗性密切相关；而胰腺癌放疗抵抗与survivin的高表达密切相关[13]。Sasaki等[14]研究表明，survivin基因的高表达水平和临床恶性胶质瘤患者的预后不佳密切相关。但是，恶性胶质瘤的放射敏感性与survivin表达之间的关系尚未见报道。

目前，基因功能研究的方法有多种，如基因敲除、反义寡核苷酸技术等，但费时费力，成本昂贵，且成功率不高。新近发展起来的RNA干涉技术，能快速有效地沉寂靶基因表达，进而从反向角度来阐明基因的功能，已成为当前研究的热点[15]。目前应用的RNA干涉技术主要有体外合成siRNA片断和DNA干涉载体两类，前者的缺陷在于转染效率低及RNA干涉作用的瞬时性，后来发展的DNA载体在细胞内表达的siRNA技术具有稳定、长久等优点[16]。本研究中使用的真核表达载体pSilencer 4.1-CMVneo含有高转录活性的CMV启动子，并携带有新霉素抗性基因，便于细胞内高效转录siRNA和稳定筛选干涉后的细胞。笔者根据siRNA序列设计原则和文献报道合成了两条shRNA序列，通过酶切鉴定及测序证明载体构建成功；同时，选择Ambion公司提供的与人类无同源性的shRNA干涉载体作为阴性对照。对于G418筛选出来的稳定转染细胞系，分别通过RT-PCR及Western blot方法分析了survivin mRNA和蛋白水平的变化，结果表明pSil 4.1-shsurvivin 2具有抑制survivin基因表达的作用，而pSil 4.1-shsurvivin 1则没有作用，因此选择U251-s2作为细胞研究模型。

通过体外克隆形成试验和皮下移植瘤试验，发现survivin基因表达下调能够显著增强胶质瘤细胞体内外放疗敏感性。这可能与survivin基因表达下调引起caspase-3和caspase-7活性增加有关，但具体机制还需要进一步的深入探讨和分析。总之，本研究表明，联合应用针对survivin为靶点的基因治疗和放射治疗能显著抑制恶性胶质瘤细胞的增殖，同时又能避免放射剂量过大引起的副作用和并发症，为恶性胶质瘤临床治疗开辟了新的思路。

图4 皮下移植瘤试验

[1]Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002[J].CA Cancer J Clin，2005，55（2）:74-108.

[2]Katz D，Ito E，Liu FF.On the path to seeking novel radiosensitizers[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2009，73（4）:988-996.

[3]Das A，Tan WL，Teo J，et al.Expression of survivin in primary glioblastomas[J].J Cancer Res Clin Oncol，2002，128（6）:302-306.

[4]Chakravarti A，Noll E，Black PM，et al.Quantitatively determined survivin expression levels are of prognostic value in human gliomas[J].J Clin Oncol，2002，20（4）:1 063-1 068.

[5]Chakravarti A，Zhai GG，Zhang M，et al.Survivin enhances radiation resistance in primary human glioblastoma cells via caspase-independent mechanisms[J].Oncogene，2004，23（45）:7 494-7 506.

[6]Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma[J].Nat Med，1997，3（8）:917-921.

[7]Li F，Ambrosini G，Chu EY，et al.Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin[J].Nature，1998，396（6 711）:580-584.

[8]Mita AC，Mita MM，Nawrocki ST，et al.Survivin:key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics[J].Clin Cancer Res，2008，14（16）:5 000-5 005.

[9]Wang TT，Qian XP，Liu BR.Survivin:potential role in diagnosis，prognosis and targeted therapy of gastric cancer[J].World J Gastroenterol，2007，13（20）:2 784-2 790.

[10]Nassar A，Sexton D，Cotsonis G，et al.Survivin expression in breast carcinoma:correlation with apoptosis and prognosis[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol，2008，16（3）:221-226.

[11]YantissRK，GoodarziM，Zhou XK，etal.Clinical，pathologic，and molecular features of early-onset colorectal carcinoma[J].Am J Surg Pathol，2009，33（4）:572-582.

[12]Montorsi M，Maggioni M，Falleni M，et al.Survivin gene expression in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma[J].Hepatogastroenterology，2007，54（79）:2 040-2 044.

[13]Guan HT，Xue XH，Dai ZJ，et al.Down-regulation of survivin expression by small interfering RNA induces pancreatic cancer cell apoptosis and enhances its radiosensitivity[J].World J Gastroenterol，2006，12（18）:2 901-2 907.

[14]Sasaki T，Lopes MB，Hankins GR，et al.Expression of survivin，an inhibitor of apoptosis protein，in tumors of the nervous system[J].Acta Neuropathol，2002，104（1）:105-109.

[15]Naqvi AR，Islam MN，Choudhury NR，et al.The fascinating world of RNA interference[J].Int J Biol Sci，2009，5（2）:97-117.

[16]Tilesi F，Fradiani P，Socci V，et al.Design and validation of siRNAs and shRNAs[J].Curr Opin Mol Ther，2009，11（2）:156-164.