氨基胍对胰岛β细胞保护作用的机理研究

何凌 何美艳 余绮玲 黄春苓 梁伟 王燕 陈定宇

我国最新糖尿病流行病学调查显示，20岁以上人群糖尿病及糖尿病前期患病率已达到9.7%和15.5%[1]，世界卫生组织预测2025年全球糖尿病患者将达3.8亿。糖尿病已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。UKPDS研究发现，在糖尿病确诊时，胰岛细胞功能仅有正常的50%，随着疾病进展，β细胞功能进行性衰退[2]，随之而来的是血糖控制的难度及成本逐渐增加，患者更容易出现各种急、慢性并发症。然而，目前的治疗方案多集中在血糖达标、在胰岛功能不断下降的基础上使其速度延缓，尚未发现确切治疗手段阻止胰岛功能进行性衰退。研究表明，氧化应激和非酶糖化在β细胞损伤过程中发挥了重要作用。若能寻找一种治疗方式阻止其反应，则为β细胞保护提供了又一可能途径。氨基胍(Am inoguanidine, AG)是一种亲核肼化物，可以有效抑制糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products, AGE)及诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Ox ide Synthase，iNOS)产生，已有动物实验证实氨基胍可预防DR-BB大鼠发生自身免疫性糖尿[3]。本研究尝试观察AG对胰岛β细胞株NIT细胞的保护作用，为胰岛β细胞的保护治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

IL-1β、IFN-γ购自R&D公司，盐酸氨基胍、DMSO、胰蛋白酶(trypsin)及EDTA购自Sigma公司。低糖型DMEM培养基及胎牛血清购自GIBCO公司；一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 细胞株

胰岛β细胞株N IT-1细胞由中南大学代谢内分泌研究所周智广教授惠赠。

1.1.3 主要仪器

倒置显微镜：ZEISS，Ax iover25 CFL，德国；CO2培养箱：Therm o scien tific Form a 371，美国；全波长酶标仪：MULTISKAN SPECTRUM，美国；紫外/可见光分光光度计：AMERSHAM Pharmacia U ltrospec 2001，美国；全自动化学发光免疫分析仪：Bayer CENTAUR，德国。

1.2 方法

1.2.1 NIT-1细胞培养与传代

N IT-1细胞培养于含10%胎牛血清的DM EM培养基，5%CO2，37℃培养，每日换液1次。待细胞生长至80%融合时，予0.125%胰酶消化细胞，加入含胎牛血清的DMEM终止反应。用滴管轻柔吹打使其成为单细胞悬液，1∶3分瓶传代。

1.2.2 细胞接种与处理

预实验选定终浓度：IL-1β50pg/m l，IFN-γ5ng/m l，氨基胍(以下简称AG)0.5mm ol/L。处于对数生长期的N IT-1细胞与以下干预因子共培养于48孔板，孵育24h。分为以下4组：①(IL-1β+IFN-γ)组、②(IL-1β+IFN-γ+AG)组、③AG组、④对照组(DM EM)。每组设3个平行孔。(IL-1β+IFN-γ+AG)组为在IL-1β及IFN-γ作用前24h加入AG预先孵育，对照组加入等量DMEM，作用后收集细胞，用于以下实验。

1.2.3 一氧化氮水平检测

硝酸还原酶法，取上清液，实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.4 诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平检测

比色法，取上清液，实验步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.5 胰岛素水平检测

取上清液，采用化学发光法，由Bayer Cen taur分析仪完成，批内CV3.0%，批间CV 4.1%。

1.3 统计学分析

计量资料用或中位数及范围表示，计数资料用阳性例数或率表示。正态分布数据2组间均数比较采用t检验，2组以上的均数比较用方差分析。非正态分布数据采用非参数检验。统计软件为SPSS11.0，显著性为0.05。

2 结果

2.1 一氧化氮、iNOS水平检测

经IL-1β联合IFN-γ刺激的N IT-1细胞，其分泌NO、iNOS水平较其他各组增高(vs AG组、对照组，P＜0.01；v s IL-1β+IFN-γ+AG组，P＜0.05)，其中AG+IL-1β+IFN-γ联合处理的N IT-1细胞与IL-1β+IFN-γ破坏组相比，分泌NO，iNOS水平下降(P＜0.05)，与AG组相比，分泌NO、iNOS水平增高(P＜0.05)，见表1。

表1 各组培养上清NO、iNOS、胰岛素水平比较

2.2 胰岛素水平检测

NIT-1细胞经IL-1β+IFN-γ破坏，分泌Ins较其他各组减少(P＜0.05)，其中AG+IL-1β+IFN-γ刺激的N IT-1细胞与IL-1β+IFN-γ刺激组相比，分泌Ins增加(P＜0.05)与AG组及对照组无差异，见表1。

3 讨论

糖尿病的发生发展涉及到遗传与环境等多种因素共同作用，目前其病因仍未明确。人们一方面在积极寻找其发病的始动机制，另一方面也在下游观察一些效应因子的作用，借此筛选出有益于保护胰岛β细胞的干预靶点。

近年来，糖基化终末产物在糖尿病进展中的作用已得到证实。AGEs是非酶糖化反应的终末期产物，可沉积于血管壁，通过氧化应激、趋化白细胞、活化蛋白激酶C等发挥作用；AGEs使内皮源性NO生成增加或灭活减少，增加内皮的促凝血活性，引起血流动力学异常。AGEs可直接导致糖尿病微血管病变如糖尿病肾病及视网膜病变。此外，AGEs通过iNOS依赖性NO生成途径来抑制细胞色素氧化酶C及ATP产生，借此导致胰岛素分泌功能受损[4]；AGE尚可沉积于胰岛损伤β细胞功能，出现胰岛素分泌缺陷及胰岛素基因启动子活性下降[5]。T细胞、巨噬细胞、单核细胞分泌的细胞因子是导致β细胞凋亡的效应因子。而细胞因子诱导的NOS(iNOS)及随后的NO分泌在β细胞损伤中起到关键作用。NOS分为3种：诱导型、内皮型、神经元型。iNOS增加使生成的一氧化氮(NO)和氧自由基(O2-)过量，致胰岛细胞内DNA断裂而破坏其结构与功能，发挥直接毒性效应；另一方面细胞因子可通过诱导β细胞表达Fas受体，与细胞表达的FasL相互作用，使β细胞凋亡[6]。

细胞因子是导致β细胞凋亡的效应因子，iNOS及NO分泌在β细胞损伤中起到关键作用。IL-1作用于大鼠胰岛细胞明显抑制胰岛素分泌并导致胰岛破环，此作用可以被iNOS抑制剂预防。胰岛是一个异质群体，除内分泌细胞外，还包含了约0.5%的组织巨噬细胞及其他比例的非内分泌细胞。胰岛内巨噬细胞可能是IL-1之来源细胞。活化的巨噬细胞同时分泌iNOS和IL-1才能导致胰岛细胞破坏，在仅有NO产生而缺乏IL-1时并不会影响β细胞功能[2]。巨噬细胞在克尔汉大鼠病毒(KRV)诱导BB大鼠发生自身免疫性糖尿病过程中起到关键性作用，其效应的发挥主要是通过诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及随之增加的NO。而予氨基胍(AG)处理可以预防糖尿病发生，其作用一方面是众所周知的抑制iNOS和NO产生，另一方面有助于维持免疫平衡[3]。

本实验在培养的胰岛N IT细胞中加入免疫破坏性细胞因子IL-1β及IFN-γ，导致NIT细胞分泌大量iNOS及NO，胰岛素分泌减少。经过AG预处理的N IT细胞，予IL-1β+IFN-γ破坏后，一氧化氮及iNOS分泌减少，其分泌水平与对照组无差异，但仍高于AG单独作用组；同时，AG+IL-1β+IFN-γ处理组胰岛素分泌较IL-1β+IFN-γ组增多，与对照组比较未见差异。提示AG可通过抑制NO及iNOS生成而减轻IL-1β+IFN-γ对N IT细胞的损伤作用，保护N IT细胞的胰岛素分泌功能。

氨基胍是一种亲核肼化物，可有效抑制细胞内和细胞外组分的非酶糖化及AGE产生。同时氨基胍也是被证实的第一个诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂，对诱导型的抑制作用较内皮型和神经元型强40～50倍[7]。过继转移实验证实了氨基胍在预防及延缓NOD鼠发生自身免疫性糖尿病中发挥了重要作用[8]。对于糖尿病微血管病变，以氨基胍抑制AGE产生可以防止视网膜毛细血管基底膜变厚、周细胞数目减少及形态异常[9]。氨基胍作为选择性iNOS抑制剂，可以增加ATP产生及胰岛素分泌，延缓小鼠糖尿病发生[4]。那么对于体外培养的胰岛细胞，是否具有直接的保护作用呢？李柏峰等[10]发现，iNOS在细胞因子诱导的大鼠胰岛细胞凋亡中起到十分关键的作用，而氨基胍通过抑制iNOS活性，减轻细胞因子对大鼠胰岛细胞的损害，降低了胰岛凋亡水平，改善胰岛的存活与功能。Koh等[11]发现，氨基胍减少2-脱氧-d-核糖所致胰岛H IT-T15细胞内氧自由基及AGEs产生。本实验也观察到了氨基胍通过抑制iNOS及NO生成而减轻细胞因子对N IT细胞的损伤作用，保护N IT细胞的胰岛素分泌功能。若能从此方面入手，将为胰岛功能的保护及糖尿病的预防与治疗研究提供更多的选择手段。

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