大鼠坐骨神经切断后相应脊髓节段Bcl-2、Bax蛋白表达及神经细胞凋亡

赵东波,孙鸿斌,李春雨,崔树森

(吉林大学中日联谊医院手外科,吉林长春130033)

周围神经损伤实质上是神经细胞轴突的损伤,必然影响相应神经细胞的存活和功能状况,从而影响神经轴突的再生和功能恢复。因此,研究周围神经再生和功能恢复的重点,应从神经胞体的功能状况、轴突再生的影响因素和效应器的恢复潜能等方面综合研究[1]。关于周围神经损伤后,相应脊髓节段运动神经元胞体内Bcl-2、Bax蛋白的表达是否明显活化以发挥其调节作用,以及损伤后不同时相表达水平的变化报道较少。本研究采用大鼠坐骨神经切断的动物模型,通过TUNEL法和免疫组化染色法检测相应节段神经细胞的凋亡及Bcl-2、Bax蛋白的表达。

1 材料和方法

1.1 动物与试剂

健康雄性Wistar大鼠35只,体重250-300 g(吉林大学动物实验室),随机分为假手术组(5只)和损伤组(30只)。实验组再分为六个小组,每组5只。实验组于伤后3天,1周,2周,4周,6周和8周6个时间点取材。主要试剂:鼠抗鼠Bcl-2抗体、鼠抗鼠Bax抗体(中山生物技术有限公司),TUNEL试剂盒,SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(Santa Cruz公司)。

1.2 模型制备、取材与固定

10%的水合氯醛3ml/kg对大鼠腹腔麻醉,术区常规消毒,做右侧臀部斜行切口,切开皮肤,钝性分离肌肉,显露坐骨神经。假手术组暴露坐骨神经后逐层缝合皮肤。实验组在梨状肌下缘处将坐骨神经完全切断,在12倍手术显微镜下,将其两端正确对位后,9-0无损伤线吻合断端4针,闭合创口,制成坐骨神经切断模型。取材:将各时间点5只大鼠腹腔麻醉后,4%多聚甲醛缓冲液心脏灌注固定,切取L4-L6段脊髓,置于5ml 4%多聚甲醛缓冲液中固定,脱水后石蜡包埋,制成厚度为3 μ m的连续横断切片备用。免疫组织化学法(SP法)检测Bcl-2、Bax蛋白的表达,TUNEL法检测运动神经元的凋亡,使用浓度及方法严格按照说明书配置。

1.3 阳性结果判定及统计学分析

从假手术组及损伤后各时间点组随机选取5张切片,在显微镜下观察Bcl-2、Bax免疫阳性反应细胞在各组大鼠脊髓的分布,通过图像分析系统进行半定量分析,以平均光度作为Bcl-2、Bax表达的定量指标,以数密度作为TUNEL法检测的定量指标。采用SPSS17.0软件进行统计学分析,运用单因素方差分析检验Bcl-2及Bax表达量在各时间点数值的不同是否有统计学意义,P＜0.05认为差异有统计学意义,并对Bcl-2/Bax值与细胞凋亡数之间进行相关分析。

2 结果

2.1 TUNEL染色结果

阳性细胞的胞核呈暗褐色。伤后3天时阳性细胞数较为稀疏,2周时阳性细胞最为稠密,图像分析系统分析结果显示,凋亡细胞的数密度在3天开始上升,2周时达高峰,以后有所下降,8周时仍有少量凋亡细胞。(见表1和图3-4)

2.2 Bcl-2、Bax 表达结果

Bcl-2和Bax阳性定位于胞浆,呈棕黄色,核不着色。假手术组均未见明显表达的阳性细胞。实验组均于损伤后3天见阳性细胞,神经元和胶质细胞均有表达。图像分析结果显示,实验组于3天开始表达量逐渐增高,2周时达高峰,此后逐渐下降,8周时仍有表达。(见表1和图1-2)

2.3 Bcl-2与Bax比值

Bcl-2与Bax比值均先下降,2周时达到最低值,然后逐渐增高。各时间点Bcl-2与Bax比值进行方差分析,结果显示,2周时Bcl-2与Bax比值的降低与其它组相比有统计学意义。(见表1和图5)

表1 大鼠坐骨神经切断伤后不同时间点Bcl-2/Bax与凋亡细胞数密度值(n=5,±s)

表1 大鼠坐骨神经切断伤后不同时间点Bcl-2/Bax与凋亡细胞数密度值(n=5,±s)

Bcl-2/Bax比值与其它时间点比较,*P＜0.05

Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax TUNEL 3 d0.213±0.0130.175±0.0191.217±0.017 0.92±0.22 1 w 0.217±0.0210.181±0.0161.199±0.005 4.69±0.24 2 w 0.227±0.0120.199±0.0211.141±0.019*10.49±0.24 4 w 0.203±0.0090.169±0.0081.201±0.010 6.38±0.17 6 w 0.201±0.0110.165±0.0181.218±0.027 5.29±0.09 8 w 0.199±0.0120.163±0.0191.221±0.021 4.36±0.16

图1 大鼠坐骨神经切断后两周Bcl-2的免疫组化染色(×200)

图2 大鼠坐骨神经切断后两周 Bax的免疫组化染色(×200)

图3 大鼠坐骨神经切断后两周脊髓神经元凋亡的免疫组化染色(×200)

图4 大鼠坐骨神经切断后不同时间点脊髓运动神经元凋亡计数

图5 大鼠坐骨神经切断后不同时间点Bcl-2/Bax平均光度比值

3 讨论

周围神经损伤后脊髓及背根神经节内神经元的存活与功能状态是目前研究的热点问题之一。凋亡是神经元死亡的重要形式。Atlasi等[2]将Wistar大鼠坐骨神经切断后,用外膜缝合法缝合,术后1周和12周通过免疫荧光和电镜观察,发现腰5背根神经节中的感觉神经元有数量的减少和凋亡形态的改变。各种不同原因导致的周围神经损伤,脊髓前角运动神经元均存在不同程度的凋亡[3]。Bcl-2和Bax是互相拮抗的两个基因,在细胞凋亡的调控中发挥着重要作用。Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)是主要的抗凋亡基因,可以抑制多种途径的凋亡。Bax(bcl-2 associated X protein)属于Bcl-2基因家族的成员,是Bcl-2的拮抗基因,通过编码相应功能蛋白而起作用[4]。Bax存在于胞浆中,接受凋亡信息后能够被激活,激活后通过末端疏水结构域锚定在线粒体膜上,使线粒体通透性发生改变致使细胞色素C、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)和凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptic protease activating factor-1,Apaf-1)释放,进而激活caspase系统,促使细胞发生凋亡。当Bax通过BH3结构与Bcl-2形成复合体后则失去了改变线粒体膜通透性的作用而不能诱发细胞凋亡[5][6]。细胞是否凋亡还与Bcl-2和Bax比值相关。当Bcl-2、Bax基因启动后,表现哪一方面的作用,主要依靠Bcl-2、Bax相对表达量的多少[7]。

本实验结果显示:假手术组Bcl-2、Bax均未见明显着色,说明Bcl-2、Bax的表达与大鼠坐骨神经损伤密切相关。实验组Bcl-2、Bax蛋白的表达均经历一个先增高后下降的过程。伤后3天时即有Bcl-2、Bax表达并开始增高,于2周时达高峰,以后逐渐下降。我们看到随着坐骨神经切断损伤时间的延长,神经元细胞受损加重,凋亡级联反应启动,Bcl-2、Bax表达上升并于同一时间达到峰值。Bcl-2与Bax表达量的平衡变化与细胞凋亡的发生与否直接相关。Bcl-2与Bax比值结果显示:各时间点中,3天时比值开始逐渐减小,2周时Bcl-2与Bax比值最小,以后比值逐渐增大。TUNEL染色结果发现:伤后3天即可见凋亡的神经细胞,2周时最多,以后逐渐下降,8周时偶可见TUNEL阳性细胞。Bcl-2和Bax比值与细胞凋亡检测结果相比较,显示出该比值与神经凋亡呈现出规律性的同步变化。本研究提示:大鼠坐骨神经切断后相应脊髓节段内存在神经细胞的凋亡,Bcl-2和Bax比值的变化是神经凋亡的重要指标。

[1]杨 萍,应大君,宋 林,等.成年大鼠坐骨神经切断后脊髓运动神经元死亡方式的研究[J].第三军医大学学报,2006,26(6):146.

[2]Atlasi MA,Mehdizadeh M,Bahadori MH,et al.Morphological identification of cell death in dorsal root ganglion neurons following peripheral nerve injury and repair in adult rat[J].Iranlan biomedical,2009,13(2):65.

[3]Gu ZZ,Pan YC,Cui JK,et al.Gene expression and apoptosis in the spinal cord neurons after sciatic nerve injury.Neurochem Int 1997,30:417.

[4]Nesic-Taylor O,Cittelly D,Ye Z,et al.Exogenous Bcl-xL fusion protein spares neurons after spinal cord injury[J].J Neurosci Res,2005,79(5):628.

[5]Antignani A,Youle RJ.How do Bax and Bak lead to permeabilization of the outer mitochondrial membrane?[J].Curr Opin Cell Biol,2006,18(6):685.

[6]Er E,Oliver L,Cartron PF,et al.Mitochondria as the target of the proapoptotic protein Bax[J].Biochim Biophys Acta,2006,1757(9-10):1301.

[7]Reed JC.Proapoptotic multidomain Bcl-2/Bax-family proteins:mechanisms,physiological roles,and therapeutic opportunities[J].Cell Death Differ,2006,13(8):1378.