布地奈德对流感病毒感染后小鼠嗅上皮嗅觉标记蛋白表达的影响

万桂莲,倪道凤,关 静

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院耳鼻咽喉科,北京100730)

上呼吸道病毒性感染是引起嗅觉障碍的常见疾病,发病率约为20-30%[1]。引起呼吸道病毒性感染的常见病原有流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠状病毒、肠道病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒和麻疹病毒,其中流感病毒对嗅觉的影响已为许多学者广泛研究[2,3]。临床上常应用糖皮质激素来治疗上呼吸道病毒性感染引起的嗅觉障碍。糖皮质激素治疗嗅觉障碍的报道较多,而对布地奈德的观察少见报道。本研究以嗅觉标记蛋白(olfactory marker protein,OMP)为研究指标,选用甲型流感病毒(HINI),模拟上呼吸道病毒感染动物模型,观察布地奈德对流感病毒感染后小鼠嗅上皮OMP的作用,以期为临床应用激素治疗嗅觉障碍提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验动物选用无致病原近交系BALB/c小鼠,雄性,六周龄,体重20±1 g,由中国医学科学院实验动物研究所提供,动物在同一条件下由中国医学科学院实验动物研究所饲养。

1.1.2 流感病毒 流感病毒鼠适应株A/PR8/34(H1N1)病毒液,由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。分装后冻存于-80℃冰箱备用。

1.1.3 主要的试剂 山羊抗鼠嗅标记蛋白抗体,购自Wako有限公司;辣根酶标记兔抗山羊抗体,非生物素二步法免疫组化检测试剂(Two-Step IHC Detection Reagent,PV-6003),购自北京中杉金桥生物技术有限公司;专用硝酸纤维(nitrocellulose,NC)膜,购自Amersham Biosciences公司;ECL增强化学发光试剂盒,购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 将50只BALB/c小鼠随机分为5组(每组10只小鼠):非感染对照组(正常对照组)、流感病毒感染对照1组(病毒对照1组),流感病毒感染对照2组(病毒对照2组),布地奈德1组,布地奈德2组,分别与病毒对照1组和病毒对照2组对照。

1.2.2 病毒接种 本实验根据Reed-Muench法测定流感病毒鼠适应株A/PR8/34(H1N1)病毒对小鼠的半数致死量(LD50)为10-3.5,根据LD50结果将流感病毒液按10-4稀释,小鼠乙醚吸入麻醉,用可调微量移液器取50 μ l病毒液,缓慢适量滴进小鼠的前鼻孔,每侧25 μ l,使病毒液随呼吸气流缓慢进入鼻腔,待麻醉恢复后,将小鼠按组分笼隔离饲养。

1.2.3 给药 经鼻吸入布地奈德组按3 mg/kg给药[4,5],布地奈德1组小鼠在病毒感染1天后开始给药,布地奈德2组小鼠在病毒感染3天后开始给药,病毒1组和病毒2组分别在相同时间点均经鼻吸入等量的生理盐水。

1.2.4 免疫组织化学染色 染色方法采用SP法。分别在第7天和第10天从每组小鼠取3只,麻醉灌注后取鼻腔标本常规固定和切片。采用PH8.0Tris-EDTA修复液,微波热修复,92-98℃,10 min,于室温中冷却,放入3%H2O2溶液室温10 min,滴加1抗OMP蛋白抗体(1∶4 000),37℃恒温箱孵育 1.5 h。滴加非生物素2抗(1∶5 000),37℃恒温箱孵育30分钟,二氨基联苯胺(DAB)试剂盒显色,染色时间为25秒,苏木素复染,水洗,盐酸酒精分化,常规脱水、透明、封片,光学显微镜观察双侧鼻腔嗅区粘膜。阴性对照实验采用正常山羊血清代替一抗,其余步骤同上。在显微镜下计数每只小鼠鼻腔切片嗅区粘膜内5个高倍视野(x400)下OMP阳性细胞数,取其平均值为该例的测量值。

1.2.5 嗅粘膜组织全蛋白提取 在第7天和第10天分别从每组取出7只小鼠,颈椎脱臼法处死小鼠,矢状位正中裂开鼻腔,解剖显微镜下取鼻中隔嗅区黏膜,经不锈钢筛网研磨过滤,留取细胞混悬液,放入离心机离心2次(4 000 r/min,5 min-1),弃上清液,加入适量的细胞裂解液(Tris HCl 2 ml,NaCL 6 ml,EDTA 0.2 ml,EGTA 0.2 ml,Tritonx-100 1 ml,焦磷酸钠 0.066 5 g,β-甘油磷酸钠 0.1 ml,原矾酸钠 10 ml,蒸馏水 85 ml),冰上裂解10分钟,超声细胞粉碎机裂解细胞8次(200 W,5 s-1,间隔5 s),再放于低温超速离心机中离心(4℃,12 000 r/min,25 min),取上清液,Bardford法检测上清液蛋白浓度。

1.2.6 western blot 根据OMP蛋白分子质量大小(20 KD),制作15%的分离胶和5%的浓缩胶,取标本细胞裂解蛋白20 μ g,进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶电压为80 V,分离胶电压为120 V,凝胶-NC膜转移装置浸于转膜缓冲液,恒压80 V转移2 h,转到NC膜上,用5%的脱脂牛奶封闭2 h,然后加入1抗山羊抗鼠嗅标记蛋白抗体(1∶2 000)封闭,放于摇床上室温2 h,洗膜后加入2抗辣根酶标记兔抗山羊抗体(1∶4 000)孵育1 h,洗膜后加ECL显像剂,将NC膜放入压片暗盒,胶片曝光显影。所获结果经灰度定量扫描,以β-actin条带为内参照,校正对应的OMP条带,测定各显色条带的吸光度值,半定量表示其表达水平。

1.3 统计学分析

所有资料采用SPSS11.0统计分析软件进行处理,所得到的数值均以±s表示,各组数据的比较应用配对t检验和独立样本t检验分析。

2 结果

2.1 OMP在嗅粘膜的表达定位和阳性率比较 光镜下OMP阳性主要定位于小鼠嗅粘膜的上皮层,呈棕褐色或浅棕色染色。正常对照组小鼠嗅上皮OMP染色阳性细胞呈棕褐色,大量分布于嗅上皮层(图1A)。病毒对照组小鼠嗅上皮OMP染色阳性细胞数量明显减少(图1B,D),而与病毒对照组相比,布地奈德组小鼠嗅上皮OMP染色阳性细胞明显增加(图1C,E)。经图像分析结果显示,布地奈德1组和布地奈德2组嗅上皮OMP阳性细胞数明显高于病毒对照1组和病毒对照2组,差异有统计学意义(P＜0.01);病毒对照1组和病毒对照2组OMP阳性细胞数分别低于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);布地奈德1组、布地奈德2组与正常对照组三组间分别比较,均没有显著性差异;病毒对照1组和病毒对照2组比较没有显著性差异(表1)。在阴性对照组的嗅上皮没有观察到OMP染色阳性细胞(图1F)。

图1 各组小鼠嗅上皮OMP表达的变化(×400)

表1 各组小鼠嗅上皮OMP阳性细胞的变化(±s,n=3)

表1 各组小鼠嗅上皮OMP阳性细胞的变化(±s,n=3)

P＜0.01,与病毒对照组比较

组别 OMP阳性细胞数正常对照组 72.44±1.31*病毒对照1组 56.12±2.10布地奈德1组 71.34±1.89*病毒对照2组 60.51±1.62布地奈德2组 70.98±1.43*

2.2 对流感病毒感染的嗅上皮布地奈德干预后OMP蛋白表达水平的变化 布地奈德1组OMP蛋白表达水平较病毒对照1组显著增高(P＜0.01),与正常对照组和布地奈德2组没有显著性差异。布地奈德2组OMP蛋白表达水平比病毒对照2组显著增高(P＜0.01),与正常对照组和布地奈德1组没有显著性差异。病毒对照1组和病毒对照2组OMP蛋白表达水平均比正常对照组明显降低(P＜0.01),而病毒对照1组和病毒对照2组两组间没有显著性差异(图2)。

图2 布地奈德对嗅上皮OMP蛋白表达的影响(±s,n=3)

3 讨论

0MP是由成熟的嗅感觉神经元表达的一种蛋白质,在嗅上皮主要存在于嗅感觉神经元的胞体内。本实验研究选择的检测指标OMP是由Margolis在1972年首先发现的[6]。Nathan等研究发现大鼠OMP的结构是一种单球形结构域蛋白,有2个长的α-螺旋和8条β折叠片断。8条β链互相折叠形成β-壳状结构组成OMP的中心。在壳状结构的另一面形成两个互相垂直的长螺旋结构,此外还有3个大的延伸的环状区域,包括环1、环2和环3。环3与EphB2受体具有同源性,这可能对于调节蛋白之间的相互作用具有重要意义[7]。目前已知OMP在嗅觉系统发育、嗅觉信号转导、嗅神经生理和神经发生等方面有重要作用[8]。

流感病毒感染和病毒复制过程可刺激机体产生和释放促炎细胞因子如 TNF-α、IL-6等[9],引起以CD4+T淋巴细胞为主的免疫反应[10],引起鼻粘膜充血水肿,妨碍气味分子与嗅粘膜表面接触,影响嗅觉。有研究表明流感病毒感染可直接损伤嗅感觉神经元,诱导其凋亡引起嗅觉障碍[3,11]。临床上应用布地奈德治疗嗅觉障碍主要是利用布地奈德的抗炎和免疫调节作用,减弱鼻粘膜的充血和肿胀,改善鼻道通气状态,以期改善嗅觉。布地奈德改善嗅觉障碍除了上述机制外,是否对嗅感觉神经元有直接作用也引起一些学者的关注。为了探讨布地奈德对病理状态下嗅感觉神经元的作用,本实验以OMP为研究指标,选用A/PR8/34甲型流感病毒感染小鼠,模拟上呼吸道病毒感染动物模型,观察布地奈德对流感病毒感染后小鼠嗅上皮OMP表达的影响,以期为临床应用布地奈德治疗嗅觉障碍提供一定的实验依据。

本实验采用免疫组化和western blot方法检测嗅上皮OMP表达水平,发现布地奈德组小鼠嗅上皮OMP的蛋白表达水平明显上调,提示布地奈德能促进小鼠嗅上皮OSNs的OMP表达。布地奈德通过与胞浆内糖皮质激素受体(glucocorti-coid receptor,GR)结合诱导受体构象发生变化,使其与核内靶基因的激素反应元件结合,激活或抑制靶基因的表达。2008年Puiols等用活检鼻息肉病理标本应用免疫组化和RT-PCR技术证实鼻用布地奈德能够上调鼻粘膜中GRα mRNA表达,GRβ表达没有显著性变化[12]。这个理论支持布地奈德参与了嗅上皮OMP蛋白表达的调节。本研究中病毒对照组小鼠嗅上皮OMP的表达量明显下降,提示流感病毒能损害OSNs而抑制OMP表达,本实验结果支持陈志宏等的观点[11]。

本研究发现布地奈德使流感病毒感染小鼠嗅感觉神经元的OMP蛋白表达增加,由此我们推测布地奈德与嗅感觉神经元胞浆内的GR结合,糖皮质激素-受体复合物进入细胞核,作用于糖皮质激素反应元件的特异性DNA序列,启动OMP基因表达,经过转录翻译合成蛋白质,影响嗅觉信号的转导,为布地奈德改善嗅觉障碍提供一定的实验依据,但本实验仅是模拟上呼吸道病毒感染动物模型,仍有一定的局限性,需要建立各种嗅觉障碍动物模型继续观察布地奈德的作用,以期为临床嗅觉障碍的治疗提供可靠的指导依据。

致谢:在本实验过程中得到中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所生物化学与分子生物学国家重点实验室许彩民教授指导和杨洋老师与实验病理中心陈锡萍老师帮助,特此感谢。

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