不同贮藏年限广陈皮黄酮类成分的变化规律研究

郑国栋， 蒋 林， 杨 雪， 杨得坡， 周 芳， 林乐维

（1.中山大学药学院，广东广州 510006;2.广州医学院基础学院，广东 广州 510182;3.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208）

广陈皮为我国岭南地区著名传统中药材，位列十大广药之一。《中国药典》（2005版）记载，陈皮为芸香科柑橘属植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮，其药材可分为陈皮及广陈皮，质量以广陈皮为优［1］。广陈皮正品为茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi’）的干燥成熟果皮，主产于广东新会，又名新会陈皮。具有理气健脾、和胃止呕、燥湿化痰等多种功效［2］。除挥发油外，广陈皮主含黄酮类成分，其黄酮类成分有两大类型:一类是黄酮苷类，主要为二氢黄酮类成分，如橙皮苷、柚皮苷等;一类是多甲氧基黄酮类，主要有川陈皮素、橘皮素等。

陈皮有“陈久者良”之说，如梁代陶弘景曰“橘皮疗气大胜，须陈久者良”，宋代苏颂云“以陈久者入药良”。目前，已有一些科学研究对这一说法进行了验证。总体来看，在挥发油方面的结论比较一致，即陈皮挥发油总量随贮藏时间的延长有下降的趋势［3，4］;在黄酮类成分方面的研究，则意见不一，且多参考《中国药典》仅以橙皮苷为指标对不同贮藏年限陈皮中该类成分的含量进行了测定［5－8］。

因此，鉴于广陈皮主含黄酮类成分，且该类成分有丰富的药理活性［9－15］，除橙皮苷外，本实验还选择了4个多甲氧基黄酮（polymethoxylated flavones，PMFs）——川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′－七甲氧基黄酮、橘皮素、5－羟基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黄酮作为指标对10批不同贮藏年限广陈皮黄酮类成分的变化规律进行了进一步的研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱系统:Shimadzu LC－20AT高效液相色谱仪，SPD－20A紫外－可见分光检测器，7725i注射阀（20 μL，Rheodyne，USA），LC solution色谱工作站软件;Milli－Q plus system超纯水仪（Millipore，Milford，MA，USA）;KUDOS SK250 LH 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）;Anke TDL－5型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 材料 10批不同贮藏年限广陈皮药材（1年到33年）系从广东省江门市新会区广东省水果良种苗木繁育场及新宝堂陈皮有限公司采集，药材经中山大学药学院生药学实验室杨得坡教授及蒋林研究员鉴定为茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi’）的干燥成熟果皮。橙皮苷、川陈皮素、3，5，6，7，8，3′，4′－七甲氧基黄酮、橘皮素、5－羟基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黄酮5种对照品由笔者从广陈皮药材中制备分离得到，经理化鉴别、光谱解析对其结构进行了确证，HPLC峰面积归一化法测定结果表明其纯度均大于98%。

1.3 试剂 色谱纯试剂:乙腈（Tedia Company，Fairfield，USA）;分析纯试剂:甲醇（天津市富宇精细化工有限公司）;怡宝纯净水（怡宝食品饮料有限公司）;超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 HPLC色谱条件 色谱柱:DIKMA Diamonsil C18column（250 mm × 4.6 mm，i.d.，5 μm）;流动相:乙腈－水;流速:1 mL/min;柱温:25℃;进样量:20 μL;检测波长:283 nm（橙皮苷）及330 nm（多甲氧基黄酮）双波长检测。梯度洗脱程序:0～15 min，25% ～50% 乙腈;15～35 min，50% ～60% 乙腈;35～40 min，60% ～85% 乙腈。在该条件下，广陈皮药材及对照品分离色谱图见图1。

图1 对照品（a）及广陈皮药材（b）HPLC分析色谱图

2.2 供试品溶液的制备 取广陈皮药材，打粉、过140目筛，取0.4 g精密称定。加入40 mL甲醇，超声提取30 min。4 000 r/min离心5 min，取上清液，浓缩后定容至25 mL量瓶中。溶液经微孔滤膜过滤，即得。

2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取橙皮苷（1，hes）、川陈皮素（2，nob）、3，5，6，7，8，3′，4′－七甲氧基黄酮（3，hep）、橘皮素（4，tan）和 5－羟基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黄酮（5，pen）5 种自制对照品，用适量甲醇溶解并定容，使之浓度分别为1.248、0.384、0.344、0.408、0.356 mg/mL，并作为标准贮备液，4℃保存、备用。临用前，用甲醇将贮备液稀释到适当浓度，即为对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围、检测限及定量限考察 精密称取对照品贮备液，用甲醇稀释配制成6个浓度水平。按建立的色谱条件，分别对不同浓度的对照品溶液进行分析，每样重复测定3次，取峰面积平均值。分别以对照品1～5的浓度X（μg/mL）为横坐标、峰面积值Y为纵坐标进行回归计算。回归方程、线性范围、相关系数见表 1。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别是当信噪比（S/N）为3和10时，化合物的浓度（μg/mL），结果见表1。

2.4.2 精密度试验 分别取高、中、低3个浓度的混合对照品溶液。进样分析，每个浓度日内测6次，连续测6 d。经计算，对照品中黄酮类成分1～5的日内及日间测定浓度的RSD均小于5%，同时准确度在95.16%～104.71%之间，表明测定方法的精密度符合分析要求。

表1标准曲线数据表（n=3）Tab.1 Calibration data for flavonoids 1～5（n=3）

2.4.3 重复性试验 取同一批广陈皮药材6份，按供试品溶液的制备方法制备，测定供试品中黄酮化合物1～5的含量。经计算，5个黄酮化合物的保留时间和含量测定值的RSD均小于3%，表明测定方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份药材，按供试品溶液的制备方法制备，分别于 0、2、4、6、8、10、24、48 h 进样，测定供试品中黄酮化合物1～5的含量。经计算，5个黄酮化合物的保留时间和含量测定值的RSD均小于3%，表明供试品溶液在48 h内稳定。2.4.5 回收率试验 精密称取已知含量的样品6份，每份0.2 g，加入混合对照品溶液适量，按供试品溶液的制备方法制备，进样分析，计算加样回收率。经计算，5个黄酮化合物的平均加样回收率在96.91% ～103.20%之间，RSD值均小于5%，表明方法的准确度良好。

2.5 样品含量测定 10批不同贮藏年限广陈皮药材，按供试品溶液的制备方法制备，进样分析，平行3次，用外标法计算药材中5个黄酮化合物的含量。10批药材含量测定结果见表2。药材黄酮类成分含量变化趋势见图2。

图2 不同贮藏年限广陈皮中主要黄酮类成分含量变化趋势图

由表2可知，10批不同贮藏年限广陈皮药材中橙皮苷的含量均在35 mg/g以上，符合《中国药典》（2005版）规定的标准（以百分含量计，≧3.5%）;除橙皮苷外，广陈皮黄酮类成分的含量以川陈皮素及橘皮素为高，3，5，6，7，8，3′，4′－七甲氧基黄酮和 5－羟基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黄酮含量较低。

3 结论与讨论

由图2可知，广陈皮中5个主要活性黄酮成分的含量随贮藏年限的不同，存在一定的变化，其变化趋势基本一致;开始时，黄酮类成分的含量随贮藏年限的延长有一定增加趋势，随后出现一定反复，但出现反复的现象更可能是由于药材质量难以统一所致。从药材采样情况来看，前3批为同一产地，贮藏时间明确，药材质量较为统一;后7批为药店市售药材，由于受到采样时间、采样地点、果树树龄、加工方式、贮藏条件及商品流通等因素的影响，药材质量难以统一。

表2 不同贮藏年限广陈皮药材中主要黄酮类成分的含量（n=3）

在以黄酮类成分为指标探讨陈皮“陈久者良”方面，曹臣等［5］认为橙皮苷是一种黄酮类苷，由芸香糖基与橙皮苷元组成，存放时间越长，陈皮内含的芸香糖与橙皮苷元结合形成的橙皮苷越多，故含量越高;林林等［6］认为，不同年份新会陈皮贮存期越长，总黄酮含量和橙皮苷含量越高;而易仑朝等［7］及丁春光等［8］则认为，不同贮存年限陈皮黄酮类化合物含量随贮存时间变化较小。

因此，结合前人的研究工作，笔者认为，随贮藏时间的延长，广陈皮黄酮类成分的含量有一定增高趋势;含量增高的原因比较复杂，既有可能与药材贮藏过程中相关酶的活性变化有关，又有可能与药材所含挥发性成分的散失有关，另外，大量文献资料表明［16－18］，植物本身所含的内生菌可以产生并促进药材活性成分的累积。因此，陈皮“陈久者良“这一说法有一定的科学依据，可能是各种原因综合导致其活性成分在贮存过程中累积增加所致，具体原因尚待进一步验证。

4 致谢

衷心感谢新会农业局、新会陈皮协会、广东省水果苗木繁育场、新宝堂陈皮有限公司等单位在样品采集及基地建设方面对本项目工作的大力支持和协助。

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