MEKC-DAD测定山茱萸饮片中獐牙菜苷和马钱苷含量

李俊松， 刘训红， 张月婵， 蔡宝昌， 尹 娣

（南京中医药大学，江苏省中药炮制重点实验室，江苏南京 210029）

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSiebl.et Zucc.的干燥成熟果肉。临床上多用酒山萸肉。山萸肉长于敛汗固脱，用于自汗或大汗不止，阴虚盗汗;经酒蒸制后，补益肝肾作用增强，常用于眩晕耳鸣，阳痿遗精，遗尿，尿频，月经过多或崩漏，腰部酸痛等［1］。另外还有清蒸品，滋补作用弱于酒蒸品［2］。现代研究表明，环烯醚萜苷、有机酸、多糖、鞣质等是山茱萸的有效成分。环烯醚萜苷成分如獐牙菜苷有抗肝细胞损伤作用［3］，马钱苷对免疫反应有双向调节作用、对半乳糖胺所致肝损伤的保护作用、对艾氏腹水瘤细胞、淋巴细胞、人骨髓瘤细胞SP20均有一定的保护作用［4］。

山茱萸的质量控制，《中国药典》2005版规定以马钱苷为控制指标，采用高效液相色谱法测定，文献也多采用高效液相色谱法测定山茱萸中环烯醚萜含量［5－7］，紫外法分光光度法测定山茱萸环烯醚萜苷总苷含量也有报道［8］。

本实验采用高效毛细管电泳法进行了山茱萸饮片中环烯醚萜苷的测定方法研究。实验中选择硼砂溶液为缓冲液，对獐牙菜苷和马钱苷的毛细管电泳迁移行为进行了研究，并考察了缓冲溶液浓度、表面活性剂浓度、有机溶剂、缓冲溶液pH、运行电压、运行温度等因素对待测物质分离的影响，建立了一种简单、快速、能同时分离测定山茱萸饮片中獐牙菜苷和马钱苷含量的毛细管电泳分析新方法。

1 仪器与试剂

Agilent型高效毛细管电泳仪（型号:G1600 AX），包括惠普化学工作站，DAD检测器，自动进样器;BUCHI旋转蒸发仪（型号:Rotavapor R－3）;AG 285电子天平;PHS－3C型PH计（上海康仪仪器有限公司）;KQ－500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

獐牙菜苷对照品（江苏省药物研究所制备）;马钱苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号:111640－200503）。其他化学试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。山茱萸酒制品为不同产地药材加工或商品饮片，编号:S1－河南 （080625），S2－陕西（080626），S3－浙 江 临 安 （080627），S4－安 徽（081201），S5－山西（081201），S1－S3 由浙江中医药大学中药饮片厂按2005年版《中国药典》加工制得，S4－S5由亳州市中药饮片厂按2005年版《中国药典》加工制得，S6－S7 由南京国医堂提供，S8－S9 由南京百草堂提供，S10－传统中医门诊部提供;山茱萸生品编号:S11－河南（Y080625），S12－陕西（Y080626）。均经作者鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSiebl.et Zucc.的干燥成熟果肉。

2 方法与结果

2.1 电泳条件 未涂渍标准熔融石英毛细管（75 μm i.d.×64.5 cm，有效长度56 cm）（Agilent科技有限公司）;检测波长:240 nm;压力进样:5 kPa×8 s;分离电压:10 kV;毛细管温度:18℃;运行缓冲液50 mmol/L 硼砂－40 mmol/L SDS－5%乙腈 （pH 9.5）。毛细管使用前以0.1 mmol/L氢氧化钠溶液、超纯水和运行缓冲液依次通过压力冲洗5、10、5 min。

2.2 对照品溶液的制备 以80%甲醇溶液为溶剂，配置獐牙菜苷、马钱苷混合对照品贮备液（獐牙菜苷192.5 mg/L、马钱苷1 210 mg/L），在冰箱中保存。在使用前，精密量取上述混合对照品贮备液1、2、4、6、10 mL 于10 mL 量瓶中，80%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜过滤，作为不同浓度的工作溶液。

2.3 供试品溶液的配制 取山茱萸粉末1 g（过50目筛），至100 mL量瓶中，精密称定，加80%甲醇50 mL，精密称定，浸渍1 h后，超声提取60 min，放冷，再精密称定，以80%甲醇补足其重量，摇匀，滤过。取滤液30 mL，水浴蒸干，80%甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察 取上述獐牙菜苷、马钱苷不同浓度的工作溶液，在选定的电泳优化条件下，测定，以对照品的峰面积（Y）对相应的浓度（X）进行线性回归，得回归方程，相关系数及线性范围;以信噪比S/N=3对应浓度确定最低检测限（LOD），以信噪比S/N=10对应浓度确定最低定量限（LOQ）。见表1。

表1 獐牙菜苷与马钱苷的标准曲线、检测限与定量限（n=2）

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度和稳定性试验 在选定的电泳优化条件下，将混合标准品溶液连续进样6次，獐牙菜苷的迁移时间RSD为0.63%，峰面积RSD为1.38%;马钱苷的迁移时间RSD为0.72%，峰面积RSD为1.98%。取上述混合对照品溶液，分别于0、1、2、4、8、16、24 h进样，獐牙菜苷的迁移时间 RSD为1.21%，峰面积RSD为2.31%;马钱苷的迁移时间RSD为0.92%，峰面积RSD为2.30%。

2.5.2 重复性试验 取河南酒制品（S1）5份，精密称定，按照2.3项下方法，分别制备供试液，在选定的电泳条件下，测定，獐牙菜苷的迁移时间RSD为1.63%，峰面积RSD为2.51%;马钱苷的迁移时间RSD为1.72%，峰面积RSD为2.38%。

2.5.3 回收率试验 精密称定河南酒制品（S1）5份，加入混合标准品各2 mL，按照2.3项下方法，制备供试液，在选定的电泳条件下，测定，以外标两点法计算含量，獐牙菜苷与马钱苷回收率分别为100.38%，100.41%;RSD分别为2.80%、2.98%，表明该方法可靠。

2.6 样品测定 在选定的电泳优化条件下，将供试品溶液注入高效毛细管电泳仪中，进行测定，以外标两点法计算含量，对照品和山茱萸样品HPCE－DAD色谱图见图1，根据相应的线性关系计算样品中獐牙菜苷与马钱苷含量，结果见表2。

表2 HPCE法测定山茱萸分析结果（n=4）

图1 对照品溶液和山茱萸样品HPEC-DAD色谱图

3 结论与讨论

3.1 电泳条件的优化 毛细管电泳（HPCE）的分离选择性及分离效率主要取决于缓冲液的类型、酸度、浓度，缓冲液添加剂、电压、温度等也有一定影响。实验对山茱萸饮片中的獐牙菜苷、马钱苷进行了分离研究，重点考察了缓冲溶液浓度、表面活性剂浓度、有机溶剂、缓冲溶液pH、运行电压、运行温度等实验条件对分离的影响。

3.1.1 缓冲液体系的选择 本实验考察了硼砂，乙酸铵，硼砂－SDS及硼砂－SDS－乙腈体系的缓冲溶液，发现选用硼砂缓冲液或乙酸铵缓冲液时，獐牙菜苷及马钱苷分离度很差，基本不能分开，但当在硼砂缓冲液中加入SDS，分离有所改善，但是獐牙菜苷及马钱苷分离度还是不能达到Rs≥1.5的要求，故需要加入有机溶剂以增加样品溶液中非水物质的溶解度，同时也会影响胶束相和流动相的性质，进而改变溶质在水相和胶束相的分配比例，有利于提高分离效率，当加入乙腈后分离度变好，Rs＞1.5。故选择硼砂－SDS－乙腈缓冲体系。

3.1.2 硼砂浓度的影响 缓冲液浓度是影响被测物迁移时间和分离度的一个重要因素，这是因为缓冲液的浓度决定了溶液的黏度系数、溶质的扩散系数以及毛细管内壁的ξ电位。本实验考察了8～50 mmol/L的硼砂缓冲溶液，结果发现迁移时间和分离度随着缓冲液浓度的升高而增大。当缓冲液浓度到50 mmol/L时对照品的峰形和分离度最佳。

3.1.3 SDS 浓度的影响 考察了10、15、20、25、30、35、40 mmol/L 7个SDS浓度下的分离情况，当SDS浓度为40 mmol/L时，山茱萸中成分的分离情况较理想，且被测组分的峰形及迁移时间较好。

3.1.4 乙腈浓度的影响 在胶束电泳（MECC）中，乙腈作为有机添加剂，有利于提高憎水溶质在水相中的溶解性，并且会影响胶束相和流动相的性质，进而改变了溶质在水相和胶束相的分配比例，有利于提高分离效率。实验考察了5%、10%、15%、20%（V/V）乙腈浓度对山茱萸中成分分离的影响，发现乙腈浓度为5%时，峰形较好，且各组分的分离也达到 Rs＞1.5。

3.1.5 缓冲溶液pH的选择 缓冲液的pH直接影响毛细管表面的ξ电势，从而影响电渗流的方向和速度，同时溶液的pH也决定样品中各组分分子的表面电荷数，从而影响组分的迁移时间和分离度，故本实验对缓冲液的pH进行了优化选择以获得较好的分离条件。考察了pH 8.8～9.5的缓冲液，发现随着pH值的增大，各组分的分离度增加而迁移时间延长，峰高亦增高，当pH为9.5时被测组分可达到基线基本分离。

3.1.6 运行电压的选择 实验在分离电压10～22 kV的条件下考察了对各组分迁移时间的影响，实验结果表明，分离电压越高，组分的迁移时间越短，不利于分离，当分离电压为10 kV时样品及对照品各待测组分可以达到基线基本分离。

3.1.7 运行温度的选择 毛细管电泳中，运行温度也影响电场的强度，从而影响电渗流速度和带电物质的迁移速率，影响分析物的迁移时间。本实验考察了运行温度15～30℃的条件下对各组分迁移时间的影响，实验结果表明运行温度越高，组分的迁移时间越短，但当运行温度为18℃时样品的各组分分离效果好，且分析时间缩短。

3.1.8 检测波长的选择 取山茱萸样品，按选定制备供试品溶液，电泳条件进样，在190～600 nm处三维图谱，结果表明240 nm各峰分离最好，因此，选择240 nm作为检测波长。

3.2 实验结果表明，不同产地或商品山茱萸酒制品中獐牙菜苷与马钱苷的含量具有一定差异，其中马钱苷以河南、陕西及安徽产的饮片较高，所有样品中獐牙菜苷含量均很低或未检出。山茱萸生品与相对应的酒制品中獐牙菜苷与马钱苷的含量也有差异，獐牙菜苷酒制后有所增加，马钱苷以酒制品升高或变化不明显，其炮制过程中含量变化规律仍需进一步探讨。

3.3 本实验建立胶束电动毛细管色谱二极管阵列检测法（MEKC－DAD）同时测定山茱萸饮片中獐牙菜苷及马钱苷含量，该方法简便、灵敏，重复性好，可用于山茱萸饮片内在质量分析的评价与控制。

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