甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板聚集和释放产物的影响

刘 洪， 潘苏华， 刘成鼎， 韦 敏， 许惠琴*

（1.南京中医药大学图书馆，江苏南京 210046;2.南京中医药大学药学院，江苏南京 210046）

血栓形成和血栓栓塞性疾病与血小板活化因子PAF直接相关，它是迄今发现的最强的血小板聚集诱导剂［1］。研究表明银杏内酯B（GB）是血小板活化因子特异性受体拮抗剂［2］，然而GB水溶性极小，临床使用受限。为使GB在治疗血栓性疾病方面有更广泛的应用，我们在GB母核上增加新的基团合成衍生物甲磺酸胺银杏内酯B，增加了水溶性，见结构式图。本试验旨在考察甲磺酸胺银杏内酯B对血小板聚集和释放反应的影响，探讨其治疗血栓性疾病的特点及作用机制。

分子式:C24H33O10N·CH4O3S甲磺酸胺银杏内酯B（dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate）

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与主要试剂 甲磺酸胺银杏内酯B，白色结晶（纯度＞98%，分子量为591.63 g/moL），由南京柯菲平医药科技有限责任公司提供，用生理盐水配制。银杏内酯B（GB），白色结晶（分子量为424.4 g/moL），购自合肥标品生物技术有限公司，用二甲基亚砜配制。曲克芦丁注射液:天津药业焦作有限公司。血小板活化因子（PAF）:SIGMA公司。钙离子指示剂Fluo－3－AM:Ivitrogen公司。TXB2放免试剂盒，6－keto－PGF1α放免试剂盒，购自北京华英生物技术研究所。其余试剂均为国产AR级。

1.1.2 动物 ♂性新西兰家兔，由南京江宁县汤山青龙山动物繁殖场提供，实验动物生产许可证:SCXK（苏）2002－0027。

1.1.3 仪器 FA－2104上皿电子天平（上海精科天平）。LDZ5－2离心机（北京医用离心机厂）。XSP－13型光学显微镜（南京江南光学仪器厂）。PAPERI型血小板聚集及血凝测定仪（北京世帝科学仪器公司）。ZT－Ⅲ多头细胞样品收集器（上海跃进医疗器械厂）。SpectraMax® Gemini XS微孔板荧光检测仪（Molecular Devices公司）。DFM－96型16管放射免疫γ计数器（合肥众成机电技术开发有限责任公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板聚集的影响

取♂性家兔48只，体重2.0～2.5 kg，随机分为6组:①对照组:0.9%氯化钠注射液。②曲克芦丁组:24 mg/kg。③GB组:3.90 mg/kg。④甲磺酸胺银杏内酯BⅠ组:1.95 mg/kg。⑤甲磺酸胺银杏内酯BⅡ组:3.90 mg/kg。⑥甲磺酸胺银杏内酯BⅢ:7.80 mg/kg。耳缘静脉连续给药5 d，给药容积均为0.5 mL/kg。末次给药15 min后颈总动脉取血，用3.8%柠檬酸钠抗凝，血液与柠檬酸钠容积之比为9∶1。800 r/min离心10 min后吸取上层血浆即得PRP。将剩余血液2 500 r/min离心10 min后吸取上层血浆即得贫血小板血浆（PPP）［3，4］。对 PRP 进行计数，若血小板浓度较高，则用PPP稀释至360×109/L。先用250 μL PPP 进行定标，然后取 250 μL PRP加入测试杯中，在37℃预温槽中预热1 min后放入测试孔，按“开始”键时立即加入诱导剂0.01 mg/mL PAF 10 μL，测定最大聚集率，每只家兔同时测定4个测试孔取均值［5］。用公式计算血小板聚集抑制率［6］。

1.2.2 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板释放产物的影响

各组末次给药后15 min取血，制备 PRP和PPP，进行血小板计数。

1.2.2.1 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板释放Ca2+的影响

（1）Flou－3－AM 导入血小板:在 4 mL PRP 中加入 4 μL Flou－3－AM（Flou－3－AM 用 DMSO 溶液配成 1 mg/mL）置37℃ 30 min，用Hepes缓冲液洗涤二次（800 r/min离心10 min，加入等体积Hepes缓冲液进行冲洗），混悬血小板（浓度大约为150×109/L）在Hepes缓冲液中待测。

（2）荧光测量:取上述负载Flou－3血小板悬液在荧光分光光度计上测定光强度（激发波长为505 nm，发射波长530 nm），计算血小板［Ca2+］i。

1.2.2.2 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板中TXA2和PGI2含量的影响

放射免疫法（RIA）测定PAF诱导家兔血小板中TXA2和PGI2含量。由于TXA2和PGI2在37℃下性质不稳定，很快水解为稳定的代谢产物TXB2和 6－keto－PGF1α，因此可测定 TXB2和 6－keto－PGF1α的含量来反映TXA2和PGI2的水平。取血小板数为360 ×109/L PRP 500 μL，加 20 μL 0.01 mg/mL PAF 反应5 min 后，立即加入20 μL 10 μmol/L 消炎痛终止反应。然后离心（1 200 r/min，5 min），取上清400 μL于－20℃保存，按RIA试剂盒说明书测定 TXB2和 6－keto－PGF1α含量。

2 结果

2.1 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板聚集的影响

甲磺酸胺银杏内酯B 1.95、3.90、7.80 mg/kg 3个剂量组、GB3.90 mg/kg组和曲克芦丁24 mg/kg组对PAF诱导的家兔血小板聚集率有抑制作用，与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。见表1。

表1 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板聚集的影响（x ± s，n=8）Tab.1 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on PAF-induced platelet aggregation in rabbit（x ± s，n=8）

2.2 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板释放产物的影响

2.2.1 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板释放Ca2+的影响

甲磺酸胺银杏内酯B1.95、3.90、7.80 mg/kg 3个剂量组对PAF诱导家兔血小板释放Ca2+均有抑制作用，在激发后10 min内与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。曲克芦丁（24 mg/kg）和GB（3.90 mg/kg）对PAF诱导家兔血小板释放Ca2+有抑制作用，与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。见表2。

2.2.2 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板中 TXB2、6－keto－PGF1α含量的影响

甲磺酸胺银杏内酯B1.95、3.90、7.80 mg/kg 3个剂量组对PAF诱导家兔血小板释放TXB2有抑制作用，并可降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值，其中甲磺酸胺银杏内酯B7.80 mg/kg剂量组与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。见表3。

表2 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔体外血小板释放Ca2+的影响（x ± s，n=8）Tab.2 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on the release of Ca2+from PAF-induced platelet in rabbits（x ± s，n=8）

表3 甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导家兔血小板中TXB2、6-keto-PGF1α含量的影响（x ± s，n=8）Tab.3 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on the contents of TXB2and 6-keto-PGF1α from PAF-induced platelet in rabbits（x ± s，n=8）

3 讨论

实验结果表明，甲磺酸胺银杏内酯B对PAF诱导的家兔血小板聚集有抑制作用，能减少血小板释放 Ca2+、TXB2，降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值。以上研究中，我们选取了曲克芦丁和GB这两个阳性对照药。既住研究发现，曲克芦丁体内给药对PAF、ADP、AA、COL 有抑制作用［7］。曲克芦丁系芦丁经羟乙基化制成的半合成黄酮化合物，能够增加红细胞和血小板表面电荷密度，抑制红细胞和血小板聚集，加强体内纤维蛋白溶解活性。而GB是甲磺酸胺银杏内酯B的前体药物，在血小板聚集和释放反应中，甲磺酸胺银杏内酯B与GB具有相似的药理活性，均能抑制血小板聚集，抑制血小板释放Ca2+、TXB2等活性物质。由于甲磺酸胺银杏内酯B增加了水溶性，若作为新药注射液开发具有一定的市场前景。

Ca2+是血小板代谢与功能的一个重要因子［8］，它参与血小板激活的许多重要环节，包括形状变化、聚集和释放。细胞内钙离子浓度（［Ca2+］i）的平衡主要由细胞内钙释放和外钙内流决定。细胞内钙释放的调节有两个最经典的通道，三磷酸肌醇（IP3）信号调节通路和Ryanodine信号调节通路。本研究中，PAF激活膜磷脂酶C，催化磷脂酰肌醇水解，产生二脂酰甘油和三磷酸肌醇促使Ca2+由血小板内的致密管道系统释放，并促使Ca2+内流导致血小板内游离Ca2+浓度升高进而触发其聚集和释放功能，使血液循环障碍进一步发展。甲磺酸胺银杏内酯B可以抑制对PAF诱导的家兔血小板释放Ca2+。由于GB是PAF受体特异性拮抗剂，因此推测，甲磺酸胺银杏内酯B可能通过竞争性抑制PAF与PAF受体的结合，从而降低PAF诱导家兔血小板Ca2+的释放。

TXA2是血小板活化的强诱导剂，也是一种致血管收缩和平滑肌细胞分裂的生物活性物质。主要由血小板合成，但也可以由单核细胞和血管平滑肌细胞（VSMCs）合成［9］。PGI2是 TXA2的内源性拮抗剂，具有抗血小板和血管的生物活性。主要由血管内皮细胞合成［10］。二者的平衡状态关系到血管健康与否。甲磺酸胺银杏内酯B可以抑制TXB2的释放，降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值。甲磺酸胺银杏内酯B可能通过血小板内多重生物放大效应平台，调节血小板内高度表达的COX－1和血栓素合成酶，从而抑制活化的血小板中TXA2合成。

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