茅根炭止血机理的实验研究

徐丹洋， 马长振， 陈佩东， 张 丽， 李 娴， 丁安伟

（南京中医药大学、江苏省方剂研究重点实验室，江苏南京 210046）

白茅根为禾本科植物白茅Imperata cylindrical（Beauv.）干燥的根。为中医临床常用中药，具有凉血止血、清热利尿的功效。现代药理研究表明，白茅根还具有抗炎［1］、镇痛［2］、促进免疫调节［3］等作用。白茅根炮制后成为茅根炭，止血作用增强，是中医临床著名止血方药十灰散中的一味。目前关于茅根炭止血机理的研究报道较少，宋劲诗［4］等通过研究表明，茅根炭和白茅根都能够明显缩短小鼠出血时间以及增强血小板聚集率，但是茅根炭的作用更强。血液凝固是一个复杂的系统过程，主要的影响因素有凝血系统、纤溶系统和血小板聚集。本实验将针对这三个因素，分别选取相应的指标测试茅根炭以及前期实验［5］中筛选出的鞣质和乙酸乙酯两个活性部位对它们的影响，以期能够从多方面揭示茅根炭止血的作用机理。

1 实验材料

1.1 动物 大鼠（SD种），♂性，体重（200±20）g，购自浙江省实验动物中心，许可证号:SCXK（浙）2003－0001。

1.2 药品与试剂 云南白药（批号:20080209）:购自云南白药集团股份有限公司;CMC－Na（批号:F20010518）:购自中国医药（集团）上海化学试剂公司;胶原（批号:117K3781）:购自Sigma公司;体外诊断试剂盒:凝血酶时间（TT、批号:STG10301－25）、凝血酶原时间（PT、批号:STG20102－36）、活化部分凝血活酶时间（APTT、批号:ST20201－29）、纤维蛋白原含量（FIB、批号:STG20401－23）、4，5－腺苷二磷酸二钠盐（ADP），均购自北京世帝科学仪器公司。ELISA试剂盒:血栓素 B2（TXB2）:（批号:LN11017110025）、6－酮－前 列 腺 素 F1α（6－keto－PGF1α）:（批号:LN11017110025）、大鼠组织型纤溶酶原激活物（t－PA）:（批号:LN11017110025）、大鼠组织型纤溶酶原激活物抑制剂（PAI－1）:（批号:LN11017110025），均购自武汉中美科技有限公司。

白茅根饮片购自南京药业股份有限公司，经南京中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为禾本科植物白茅Imperata cylindrica（Beauv.）的干燥根茎（批号:080214）。

1.3 仪器 酶标仪（Bio－Rad公司，680型）、血小板聚集凝血因子分析仪（北京世帝科学仪器公司，LGPABER）、离心机（上海安亭科学仪器厂，Anke LXJIIB）、电子天平（上海精密科学仪器有限公司，YP601N）。

1.4 供试品制备 云南白药供试液配制:云南白药临床用量为2 g/60 kg，实验动物按临床用量20倍给药，即0.667 g/kg。取云南白药粉末6.67 g加入0.5%CMC－Na 200 mL研磨均匀即得云南白药供试品液。

白茅根炭品供试液配制:取适量生品白茅根，310℃炒制4 min［5］至黑褐色，制成白茅根炭品。粉碎后过160目筛。因其临床（十灰散）用量为9 g/60 kg，经过换算后即取白茅根炭粉末30 g，加入200 mL 0.5%CMC－Na溶液混匀即得炭品供试品液。

白茅根生品供试液配制:取生品白茅根粉末35.7 g（相当于茅根炭粉30 g）加入200 mL 0.5%CMC－Na溶液混匀即得生品供试品液。

白茅根炭鞣质供试液配制:取30 g白茅根炭粉末，按2005版《中国药典》中鞣质的提取方法进行提取，将提取液浓缩到1 g/mL后加入0.5%CMCNa溶液制成相当于0.15 g/mL炭品的供试品液，即得茅根炭鞣质供试品液。

白茅根炭乙酸乙酯供试液配制:取适量白茅根炭粉末，以70%乙醇回流提取2次，回收乙醇，挥至无醇味，蒸馏水溶解，用乙酸乙酯少量多次萃取，回收乙酸乙酯得浸膏（得率2.8%）。取0.84 g浸膏（相当于30 g茅根炭粉）加入200 mL 0.5%CMCNa溶液研匀，即得供试品液。

2 实验方法

2.1 对 PT、TT、APTT、FIB影响的测定［6］取大鼠（SD种）60只，♂性，体重（200±20）g，随机分为6组，每组10只，分别为空白对照组（0.5%CMCNa），阳性对照组（云南白药），茅根生品组，茅根炭品组，茅根炭鞣质组，茅根炭乙酸乙酯组。按2 mL/100 g每天灌胃给药1次，连续10 d。于第10天给药1 h后，颈总动脉插管取血，放入加有枸橼酸钠（3.8%）的离心管内（抗凝剂与血液比例:1∶9），摇匀，血液标本放置不超过3 h，以3 000 r/min离心10 min，分离血浆。按各指标试剂盒的要求进行凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆纤维蛋白原（FIB）的测定。

2.2 血小板聚集功能的测定 取大鼠（SD种）60只，♂性，体重（200±20）g，分组及给药方法同上。于第10天给药1 h后，颈动脉插管取血，放入加有枸橼酸钠（3.8%）的离心管内，摇匀。以800 r/min离心10 min，取上层液即为富血小板血浆（PRP）;余下部分再以3 000 r/min离心10 min，取上清液即为贫血小板血浆（PPP）［7］。按 Born 比浊法［8］测定血小板最大聚集率。

2.3 TXB2、6－keto－PGF1α、t－PA 和 PAI－1 的测定 取大鼠（SD种）60只，♂性，体重（200±20）g，分组及给药方法同上。于末次给药1 h后，颈动脉插管取血，加入放有肝素（1%）溶液的离心管内抗凝。以3 000 r/min离心10 min，分离血浆，严格按试剂盒说明书步骤操作，用 ELISA 法，测定 TXB2、6－keto－PGF1α、tPA 和 PAI－1 的含量。

2.4 统计学处理方法 统计采用SPSS13.0统计软件对数据进行方差分析，实验数据以±s表示。

3 实验结果

3.1 各供试品对大鼠PT、TT、APTT、FIB的影响与空白对照组比较，茅根炭品组，茅根炭乙酸乙酯组均能显著缩短大鼠凝血酶时间和凝血酶原时间。而炭品鞣质组和生品组对两者则没有影响。结果见表1。

表1 各组供试品对大鼠PT和TT的影响（±s，n=10）

表1 各组供试品对大鼠PT和TT的影响（±s，n=10）

注:与空白对照比:*P＜0.05，**P ＜0.01。

组别 剂量/（g/kg）PT/s TT/s空白对照 － 17.30±1.31 37.30±3.60云南白药 0.667 14.82±1.00** 35.72±1.55白茅根生品 3.00 16.47±1.23 36.61±3.64白茅根炭品 3.00 15.36±1.00** 34.05±2.24*白茅根炭鞣质 3.00 17.05±1.52 35.66±2.11白茅根炭乙酸乙酯 3.00 15.87±1.46* 33.95±2.96*

与空白对照组比较，茅根炭品组，鞣质组，乙酸乙酯组均能明显缩短大鼠的活化部分凝血活酶时间。同时茅根炭品组和鞣质组还能够增加提高血液中纤维蛋白原的含量。结果见表2。

表2 各组供试品对大鼠APTT和FIB 的影响（±s，n=10）

表2 各组供试品对大鼠APTT和FIB 的影响（±s，n=10）

注:与空白对照比:*P＜0.05，**P ＜0.01。

组别 剂量/（g/kg） APTT/s FIB/（g/L）空白对照 － 14.39±1.91 3.17±1.08云南白药 0.667 13.61±1.14 4.87±0.77＊＊白茅根生品 3.00 13.12±2.27 3.76±0.19白茅根炭品 3.00 12.29±2.40* 4.33±0.02＊白茅根炭鞣质 3.00 12.07±0.78** 4.26±0.14＊白茅根炭乙酸乙酯 3.00 12.48±1.69*3.88±0.73

3.2 各组供试品对大鼠血小板聚集率的影响 实验结果表明，茅根炭品组均明显提高ADP和胶原诱导的血小板聚率;茅根炭乙酸乙酯组对两者诱导的血小板聚集均无明显促进作用。茅根炭鞣质组能显著提高ADP诱导的血小板聚集（P＜0.01），但对胶原诱导的血小板聚集功能的影响不显著。结果见表3。

表3 各组供试品对ADP和Coll诱导的大鼠血小板聚集率的影响（±s，n=10）

表3 各组供试品对ADP和Coll诱导的大鼠血小板聚集率的影响（±s，n=10）

注:与空白对照比:*P＜0.05，**P ＜0.01。

组别 剂量/（g/kg）ADP最大聚集率/%胶原最大聚集率/%空白对照 —46.31±8.82 45.97±5.09云南白药 0.667 59.14±5.13** 53.54±7.17*茅根生品 3.00 50.67±7.82 41.58±5.71茅根炭品 3.00 54.97±5.85* 52.51±5.53*茅根炭鞣质 3.00 60.61±9.63** 50.98±5.88茅根炭乙酸乙酯3.00 52.17±5.91 49.07±4.07

3.3 各组大鼠 TXB2和6－keto－PGF1α的含量 与空白对照组比较，茅根炭鞣质组能够明显提高TXB2的含量而降低6－keto－PGF1α的含量。茅根炭乙酸乙酯组对TXB2含量的提高没有显著影响，但能显著降低6－keto－PGF1α的含量。而炭品组对两者的含量没有显著影响。结果见表4。

表4 各组供试品对大鼠血浆TXB2和6-keto-PGF1α含量的影响（±s，n=10）

表4 各组供试品对大鼠血浆TXB2和6-keto-PGF1α含量的影响（±s，n=10）

注:与空白对照比:*P＜0.05，**P ＜0.01。

组别 剂量/（g/kg）TXB2/（pg/mL） 6－keto－PGF1α/（pg/mL）空白对照 —26.89±14.30 12.08±5.19云南白药 0.667 45.77±14.59* 5.61±2.90*茅根生品 3.00 35.08±8.36 20.08±11.14茅根炭品 3.00 44.00±12.91 6.34±3.68茅根炭鞣质 3.00 57.90±26.06* 6.15±1.56*茅根炭乙酸乙酯 3.00 40.43±19.83 2.48±1.34**

3.4 各供试品对大鼠组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）与纤溶酶原激活物抑制剂（PAI－1）的影响 实验结果表明，茅根各供试品溶液对大鼠纤溶酶原激活剂和纤溶酶原激活物抑制剂的含量没有影响。结果见表5。注:与空白对照比:*P＜0.05，**P＜0.01。

表5 各供试品对大鼠t-Pa和PAI-1的影响（±s，n=10）

表5 各供试品对大鼠t-Pa和PAI-1的影响（±s，n=10）

组别 剂量/（g/kg）纤溶酶原激活剂/（IU/mL）纤溶酶原激活物抑制剂/（IU/mL）空白对照 —0.35±0.07 0.04±0.03云南白药 0.667 0.24±0.01 0.16±0.12*茅根生品 3.00 0.38±0.08 0.03±0.01茅根炭品 3.00 0.32±0.05 0.08±0.09茅根炭鞣质 3.00 0.36±0.09 0.06±0.06茅根炭乙酸乙酯3.00 0.41±0.02 0.04±0.03

4 讨论

4.1 凝血过程是复杂的，医学上常用瀑布流学说来解释凝血机理。简单的瀑布流学说就是凝血有内源性、外源性途径和四个关键步骤，即:（1）启动;（2）血液凝血活酶形成;（3）凝血酶形成;（4）形成稳定的纤维蛋白。所以本实验选择了PT、TT、APTT、FIB四个指标来研究茅根炭及其有效部位对凝血系统的作用，既能反映内源性（主要通过APTT反映）、外源性（主要通过PT反映），又能反映其关键的四个步骤（PT、TT、APTT、FIB 四个指标共同反映）。

从实验数据来看，茅根炭对大鼠凝血系统的四个指标均有显著的作用，说明茅根炭既能影响外源性途径也能影响内源性途径，达到增强止血作用的效果，但是对外源性凝血途径的影响更大一些（P＜0.01）。茅根炭鞣质部位主要是通过影响内源性凝血因子和纤维蛋白原来达到增强止血作用的效果，而乙酸乙酯部位除了对纤维蛋白原没有影响外，对其它内外源性凝血系统都有影响。

4.2 本实验选择了血小板聚集率以及血栓素B2（TXB2）、6－酮－前列腺素 F1α（6－keto－PGF1α）作为指标来研究各供试品对血小板聚集的影响。血小板的吸附、聚集作用在止血初期具有重要意义。血小板聚集在人类可观察到二个聚集时相。第一相聚集是由ADP或Adr等直接作用于血小板而发生的，第二相聚集则是由于ADP、Adr或Coll等刺激血小板释放内源性ADP和TXA2等再次作用于血小板而引起的聚集［9］。茅根炭品对ADP和Coll诱导的第一相聚集和第二相聚集均有促进作用。而茅根炭鞣质组则只对ADP诱导的第一相聚集有作用但作用强于茅根炭（P＜0.01）。说明茅根炭作为整体通过多途径促进血小板聚集。

TXA2和PGI2是调节血管壁紧张性的一对重要血管活性物质。TXA2可使血管痉挛，促进血小板聚集和血栓形成。PGI2是内皮细胞中花生四烯酸代谢的环氧合酶产物，是强血管扩张剂，可抑制血小板聚集。PGI2和TXA2之间的动态平衡对维持血流动力学稳定起重要作用，PGI2和TXA2体内半衰期很短，可通过检测TXA2和PGI2在血浆中的代谢产物TXB2和6－keto－PGF1α 的含量，来了解血浆中 TXA2和PGI2的变化。

实验结果表明茅根炭对 TXB2和 6－keto－PGF1α的含量没有影响，但是鞣质部位则能显著的升高TXB2的含量而降低 6－keto－PGF1α的含量。由于鞣质部位对血小板第二相聚集没有显著影响，则说明其可能通过直接影响花生四烯酸的合成或代谢来影响TXB2和 6－keto－PGF1α的含量，从而促进血小板聚集。茅根炭乙酸乙酯部位能显著降低6－keto－PGF1α的含量，说明其可以抑制PGI2的合成。

4.3 本实验选择了纤溶酶原激活剂（t－PA）和其抑制剂（PAI－1）两个指标来研究茅根炭各供试品对纤溶系统的作用。（t－PA）、（PAI－1）是纤溶系统的主要成分，两者均由血管内皮细胞合成，是纤溶系统关键性调节物质，在纤溶系统的活化过程中占有重要的地位。两者之间的动态平衡对维持正常的血液流动有着重要意义。两者失衡将导致出血或血栓形成。

通过分析实验数据后发现，茅根炭及各供试品溶液对（t－PA）、（PAI－1）两个指标没有显著影响，说明纤溶系统对供试品的止血作用没有贡献。

综上，茅根炭主要是通过影响大鼠的凝血系统和血小板聚集而达到增强止血作用的效果，而茅根炭的鞣质或乙酸乙酯部位对大鼠凝血系统和血小板聚集功能呈现出不同的影响，说明茅根炭作为多成分的整体是通过多靶点来发挥疗效作用的。但究竟是茅根炭中的什么成分或成分组合起作用还有待进一步研究。随着血栓与止血研究的快速发展，炭药止血机理研究可以在蛋白质组学、分子生物学、床边凝血分析技术、生物芯片技术等领域进行研究。

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