跌打止痛巴布剂中蛇床子、独活、川芎等药味的鉴别研究

2010-02-07刘新国周莉玲郭丽蓉

中成药 2010年12期

刘新国，周莉玲，郭丽蓉

(广州中医药大学中药学院，广东广州510006)

跌打止痛巴布剂是将蛇床子、独活、川芎、大黄等七十七味中药经超临界二氧化碳萃取后，加入丁香罗勒油、桂皮油等九味挥发油制成的水凝胶型膏贴剂，具有活血化瘀、消肿止血、行气止痛、收敛生肌的功效，对治疗跌打损伤、火伤烫伤、刀伤出血具有显著的作用。本方成分复杂，药味间相互干扰大，制剂质量控制难度较大。本实验根据贴膏剂下巴布剂制剂通则，结合跌打止痛巴布剂自身特点，采用薄层色谱法和气相色谱法鉴别方中主要药味，方法简便易行，准确可靠，可有效控制制剂质量，为今后含挥发油膏贴剂型的研究及挥发性成分含量测定提供参考。

1 仪器与试药

ZF－I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)，Agilent 6890N气相色谱仪(安捷伦)及配套工作站，石英毛细管柱(phenomenex ZB－WAX，长 30 m，内径 0.32 mm ，涂层 0.5 μm)。

蛇床子对照药材(批号121030－200405)、独活对照药材(批号120940－200809)、川芎对照药材(批号120918－200809)、大黄对照药材(批号 120902－200609)、蛇床子素对照品(批号 110822－200406)、大黄酚对照品(批号 110796－200716)、桉油精对照品(批号 110788－200903)、樟脑对照品(批号 747－200606)、薄荷脑对照品(批号 0728－00005)、异龙脑对照品(批号 1512－200201)、龙脑对照品(批号 110881－200202)、水杨酸甲酯对照品(批号 110707－200107)、茴香醛对照品(批号 1545－200001)、桂皮醛对照品(批号 110710－200714)、丁香酚对照品(批号 725－200209)，以上对照药材与对照品均购自中国药品生物制品检定所，萘(纯度＞99%，sigma)，其他试剂均为分析纯，水为纯净水。

跌打止痛巴布剂(广州敬修堂药厂，批号:081116、081117、081118，规格:10 cm ×6 cm，含膏量6 g/片)。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 蛇床子、独活鉴别

2.1.1.1 供试品溶液制备取本品5片，剪成宽约1 cm条带状，揭去盖衬，加甲醇150 mL，浸渍1 h，滤过，滤液浓缩至10 mL，残液加水20 mL，用乙醚分两次萃取，每次30 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加乙酸乙酯1mL溶解，作为供试品溶液。

2.1.1.2 对照药材溶液制备取蛇床子、独活对照药材各0.3 g，分别加无水乙醇5 mL，超声处理10 min，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。

2.1.1.3 对照品溶液制备取蛇床子素对照品，加无水乙醇制成1 mL含0.1 mg溶液。

2.1.1.4 阴性对照溶液制备取缺蛇床子和独活的阴性样品，同蛇床子、独活供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

2.1.1.5 照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录ⅥB)试验精密吸取上述4种溶液各6 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷－甲苯－乙酸乙酯(2∶3∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。

2.1.2 川芎薄层鉴别

2.1.2.1 供试品溶液制备取本品10片，剪成宽约1 cm条带状，除去盖衬，加甲醇300 mL，浸渍1 h，滤过，滤液浓缩至20 mL，残液加乙醚100 mL，置水浴上回流提取两次，每次30 min，合并乙醚层，挥干，残渣加乙酸乙酯1mL溶解，作为供试品溶液。

2.1.2.2 对照药材溶液制备取川芎对照药材0.5 g，加甲醇25 mL，超声处理10 min，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。

图1 蛇床子素的薄层鉴别

2.1.2.3 阴性对照溶液取缺川芎的阴性样品，同川芎鉴别供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

2.1.2.4 精密吸取上述3种溶液各6 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷－乙酸乙酯(6∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置，显现相同颜色斑点，阴性对照无干扰，见图2。

图2 川芎的薄层鉴别

2.1.3 大黄薄层鉴别

2.1.3.1 供试品溶液制备取本品10片，剪成宽约1 cm条带状，除去盖衬，加甲醇300 mL，浸渍1 h，滤过，滤液浓缩至20 mL，残液加水90 mL，再加盐酸9 mL，置水浴上加热30 min，立即冷却，用乙醚分两次萃取，每次150 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.3.2 对照药材溶液制备取大黄对照药材0.2 g，加甲醇20 mL，超声处理20 min，滤液挥干，残渣加水10 mL溶解，再加盐酸1 mL，加热回流30 min，立即冷却，用乙醚分两次萃取，每次20 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2 mL溶解，作为对照药材溶液。

2.1.3.3 对照品溶液制备取大黄酚对照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3.4 阴性对照溶液制备取缺大黄的阴性样品，同大黄鉴别供试品溶液制备方法处理，制成大黄阴性对照溶液。

2.1.3.5 精密吸取上述4种溶液各6 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G板上，以正己烷－乙酸乙酯(6∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气饱和展开槽中显色至斑点清晰，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点，阴性对照无干扰，见图3。

图3 大黄的薄层鉴别

2.1.4 薄层鉴别方法耐用性考察

2.1.4.1 不同薄层板的比较以上3个薄层鉴别试验，以羧甲基纤维素钠为黏合剂手铺硅胶G薄层板鉴别效果均优于预制硅胶G板。

2.1.4.2 不同湿度的比较取点样后的薄层板分别于湿度22%和75%的层析缸中展开，显色，检视。结果表明在相对湿度22%～75%之间，鉴别效果均无明显变化。

2.1.4.3 不同温度的比较取点样后的薄层板分别在4℃和30℃条件下展开，显色，检视。结果表明在4℃ ～30℃温度范围内对鉴别效果均无明显影响。

2.2 气相色谱鉴别

2.2.1 混合对照品贮备液的制备精密称取桉油精、樟脑、薄荷脑、异龙脑、龙脑、水杨酸甲酯、茴香醛、桂皮醛、丁香酚对照品适量，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 内标溶液取萘适量，精密称定，加无水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 混合对照品溶液的制备精密量取混合对照品贮备液和内标溶液各250 μL，至10 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 供试品溶液取跌打止痛巴布剂5片(含药膏30 g)，剪成1 cm宽小条，去除盖衬，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加水500 mL，连接挥发油提取器，自提取器上端加水使充满刻度，并溢流入烧瓶为止。连接回流冷凝管，加热回流5 h，放冷，分取油层，用铺有无水硫酸钠的漏斗滤过，精密称定重量。从中精密称取挥发油100 μg，加入内标溶液250 μL，无水乙醇稀释至10 mL，摇匀，即得。

2.2.5 阴性对照溶液制备取缺桉油、樟脑、薄荷油、冰片、水杨酸甲酯、八角茴香油、桂皮油、丁香罗勒油的阴性样品，按供试品溶液相同方法处理，制成溶液。

2.2.6 色谱条件以石英毛细管柱为色谱柱，柱温为程序升温，80℃保持2min后开始升温，以5℃/min升温至140℃，保持8 min，再以12℃/min升温至220℃;进样口温度为210℃;检测器为氢火焰离子化检测器(FID)，温度为245℃;载气为高纯氮气，流速:1 mL/min;进样量为1 μL;分流比40∶1;理论板数按丁香酚峰计算不低于50 000。

按上述色谱条件，分别取供试品溶液、混合对照品溶液、阴性对照溶液1μL进样测定，采用相对保留值法进行色谱峰的指认。从结果可以看出，各指标峰之间分离良好，供试品溶液相对保留时间与对照品溶液相对保留时间出现相应特征峰，阴性对照无干扰。色谱图见图4～图6。

图4 供试品溶液色谱图

图5 混合对照品溶液色谱图

3 讨论

3.1 按2005版《中国药典》收载大黄药材薄层鉴别项目，365 nm紫外光下应检视到五个暗红色斑点，按Rf值从小到大依次为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚。而跌打止痛巴布剂所采用超临界二氧化碳萃取技术主要是针对极性较小成分进行萃取，薄层色谱图中虽未发现大黄酚以外大黄成分，但鉴别结果并无干扰，且试验结果与采用《中国药典》大黄鉴别方法所得结果一致，因此采用上述方法鉴别方中大黄成分还是可行的。