人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266对TRAIL耐药的机制探讨

浦践一，魏晓璇，沈 扬

(华北煤炭医学院附属医院，河北唐山063000)

TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)家族中的重要一员，其生物学特点是仅诱导多种组织来源的肿瘤细胞、转化细胞或病毒感染细胞凋亡，而对正常组织细胞没有影响。目前已发现5种TRAIL受体，分别是死亡受体DR4、DR5，诱捕受体DcR1、DcR2和可溶性受体Oseoprotegerin(OPG)。DR4和DR5均含有“死亡结构域”，可通过死亡受体信号传导途径诱导凋亡的发生;而DcR1和DcR2均缺乏细胞内信号传导系统，不能将凋亡信号向下传递，但均能竞争性与TRAIL结合，干扰凋亡信号的传导。2008年12月～2009年12月，我们观察了TRAIL对RPMI8226和U266的形态及其TRAIL受体表达水平的影响，探讨TRAIL对人多发性骨髓瘤的作用机制及细胞对其的耐药机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Triol、逆转录反应体系及总RNA提纯试剂盒(北京赛百盛);琼脂糖及绿色体系(Promega，USA);人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226及U266，用含20%胎牛血清RPMI1640培养基培养，在37℃、5%CO2、饱和湿度环境孵育。

1.2 实验方法

1.2.1 TRAIL干预 取对数生长期的RPMI8226细胞及U266细胞，调整细胞密度为2×105/ml，接种于24孔培养板，分别加入终浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/ml的 TRAIL，作用24 h 后收集细胞。

1.2.2 细胞形态学观察 倒置显微镜下观察不同浓度的TRAIL作用后RPMI8226及U266细胞的形态学变化。

1.2.3 TRAIL受体mRNA表达检测 收集TRAIL作用后的RPMI8226细胞及U266细胞，Trizol提取细胞总RNA，电泳鉴定RNA并定量，逆转录合成cDNA。采用半定量RT-PCR法。取上述8 μl产物经2%琼脂糖凝胶电泳50 min，在读胶仪(AlphaImager1200)上进行扫描，相应位置上显示有条带者，为有目的基因的表达。各基因mRNA的相对表达水平以其各自的灰度值除以相同标本β-actin mRNA的灰度值表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS 10.0统计软件。计量数据以±s表示。对资料进行正态性检验和方差齐性检验。采用ANOVA方差分析，方差齐组间两两比较采用q检验，方差不齐组间两两比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学变化 倒置相差显微镜观察RPMI8226细胞半贴壁生长、U266细胞悬浮生长，致密细胞团样，胞膜完整无破损，胞质透明无颗粒。经TRAIL 5 μg/ml处理后24 h可以见到典型的凋亡形态学改变，表现为部分细胞悬浮，折光性减低，细胞体积变小、变形。随着药物浓度的增加及药物作用时间延长，悬浮细胞明显增加，出现细胞培养液混浊，折光性进一步减低，并且出现细胞裂解碎片。而U266细胞的形态学无明显变化。

2.2 TRAIL受体mRNA水平表达 DR5 mRNA仅表达于RPMI8226细胞中(见图1)，DcR1 mRNA仅表达于U266细胞中(见图2)。而DR4和DcR2在RPMI8226与U266细胞中未见表达。

图1 不同质量浓度TRAIL作用24 h DR5 mRNA水平表达变化

图2 不同质量浓度TRAIL作用24 h DcR1 mRNA水平表达变化

3 讨论

TRAIL受体与TNFR1和Fas具有较高的同源性，而死亡受体和诱骗受体的序列之间亦具有相当的一致性。DR4和DR5广泛分布于多种正常组织，在活化T细胞和多种肿瘤细胞中均有表达;含有与TNFR1和Fas相似的胞内段“死亡结构域”(DD)，具有凋亡诱导活性;而诱骗受体主要分布于正常组织，其中DcR1无胞内段，无信号传导功能，不能将凋亡信号下传，DcR2的胞内段仅含截断的“死亡结构域”，DcR1、DcR2与 DR4、DR5竞争性结合TRAIL，干扰凋亡信号的传导，对细胞凋亡起抑制作用。DcR2还可通过核因子-κB(NF-κB)抑制细胞凋亡［1］。OPG是一种分泌型糖蛋白，与 DcR1和DcR2一样具有抑制凋亡的作用，可干扰表达ODF的成骨细胞或基质细胞与表达ODF受体的破骨细胞前体细胞结合，从而抑制破骨细胞分化成熟，使骨密度增加［2］。

TRAIL与受体结合后促进其形成三聚体，从而进一步激活下游的多种效应分子。TRAIL受体通过DD区与结合器蛋白Fas相关的死亡结构域(FADD)的DD结合，而使其募集至受体部位，FADD又通过其氨基端死亡效应区(DED)与Caspase-8的DED结合，形成死亡诱导信号传导复合物(DISC)，使Caspase-8得以活化并发生自身磷酸化，从而进一步启动下游Caspase蛋白酶解级联反应，最后活化执行激酶Caspase-3和剪切Bid。后者促使线粒体膜渗透性通透孔开放，实现跨膜电位丢失，细胞色素C(CytC)外溢至胞质，迅速诱导细胞凋亡的发生［3］。TRAIL凋亡途径在胸腺细胞发育、病毒感染细胞和自身反应T细胞的清除及NK细胞、单核细胞、树突状细胞、T细胞等免疫应答细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤等方面具有重要意义［4，5］。除了通过 Caspase途径诱导细胞凋亡外，TRAIL受体还可通过FADD/Caspase-8激活其他信号传导途径导致癌基因c-fos、NF-κB 和 JNK 活化［6］。

本研究证实，TRAIL可诱导RPMI8226细胞凋亡，而无法诱导U266细胞凋亡。通过对RPMI8226和U266细胞中表达的TRAIL相关受体(DR4、DR5、DcR1、DcR2)的测定，证明 TRAIL受体DR5在 RPMI8226中的表达水平高于 U266中的表达;而TRAIL受体DcR1在U266中的表达水平高于RPMI8226中的表达，TRAIL受体DR4和DcR1在RPMI8226与U266中均无表达。提示TRAIL对MM细胞有选择性毒性作用，TRAIL与其受体DR5结合后激活Caspase途径诱导人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞凋亡;而 DcR1受体竞争性结合TRAIL，干扰凋亡信号的传导，对细胞凋亡起抑制作用，从而使U266细胞对TRAIL耐药。

［1］Degli-Esposti MA，Dougall WC，Smolak PJ，et al.The novel receptor TRAIL-R4 induces NF-κB and protect incomplete death domain［J］.Immunity，1997，7(6):813-820.

［2］Yasuda H，Shima N，Nakagawa N，et al.Identity of osteoc-lastogenesis inhibitory factor(OCIF)and osteoprotegerin(OPG):a mechanism by which OPG/OCIF inhitits osteoc-lastogenesis in vitro［J］.Endocrinology，1998，139(3):1329-1337.

［3］Jia L，Patwari Y，Kelsey SM，et al.TRAIL-induced apoptosis in typeⅠleukemic cells is not enhanced by overexpression of bax［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，283(5):1037-1045.

［4］Simon AK，Williams O，Mongkolsapaya J，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in T cell development:sensitivity of human thymocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(9):5158-5163.

［5］Clarke P，Meintzer SM，Gibson S，et al.Reovirus-induced apoptosis is mediated by TRAIL［J］.J Virol，2000，74(7):8135-8139.

［6］Sarker M，Ruiz-Ruiz C，Lopez-Rivas A.Activation of protein kinase C inhibits TRAIL-induced caspases activation，mitoc-hondrial eventsand apoptosis in a human leukemic T cell line［J］.Cell Death Differ，2001，8(2):172-181.