甘草酸二铵对溃疡性结肠炎大鼠结肠炎症及MCP-1表达的影响

原 皓，李时光，崔慎茹

(潍坊医学院临床学院，山东潍坊261031)

溃疡性结肠炎(UC)是一种主要累及直肠、结肠黏膜的慢性非特异性炎症，目前其确切发病机制仍不清楚且无特异性根治措施。甘草酸二铵(DG)是甘草活性成分甘草次酸的左旋构型，具有与皮质类固醇类似的非特异性抗炎作用［1，2］。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是趋化因子CC类亚家族成员之一，可促进多种细胞因子和炎症介质分泌。2009年7月，我们观察了DG对UC大鼠结肠炎症及结肠组织MCP-1表达的影响，旨在进一步探讨其抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雌性SD大鼠30只，体质量(230±10)g，4～5周龄，由山东中医药大学实验动物中心提供;2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，RT-PCR 检测试剂盒，DG (商品名甘利欣，水针剂，批号H10940190)。

1.2 动物分组及处理 将30只雌性SD大鼠适应性喂养1周后随机分为观察组、模型组和对照组各10只，均禁食、不禁水 24 h，10%水合氯醛 4.5 ml/kg腹腔注射麻醉，观察组、模型组参照文献方法［3］制作UC模型:大鼠取头低尾高体位，将聚乙烯导管经肛门缓慢插入结肠8 cm并经其注入TNBS(与无水乙醇以1∶1混匀)50～60 mg/kg，倒提大鼠30 s后使其平躺，自然清醒、常规饲养。其后观察组和模型组于造模第1～10天分别腹腔注射DG 40 mg/(kg·d)及生理盐水2 ml;对照组操作同模型组，但以生理盐水代替TNBS。造模第10天时处死动物，取距肛门约8 cm处结肠，沿肠系膜纵轴剪开，冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干称重，将结肠沿长径切成相等两份，一份以4%多聚甲醛固定，每段结肠自距肛门1、3 cm处取2块组织标本，另于炎症严重或溃疡处取1块组织标本，石蜡包埋、切片(厚4 μm)，HE染色观察组织学改变;另一部分称重后置-80℃冰箱备用。

1.3 结肠炎症评价 实验期间每日记录各组粪便性状、体质量及肠镜表现。采用疾病活动指数(DAI)评分及组织学损伤评分评价结肠炎症:①DAI评分:造模后10 d综合大鼠体质量下降百分率(不变计0分，1% ～5%计1分，6% ～10%计2分，11%～15%计3分，＞15%计4分)、大便黏稠度(正常计0分，松散计2分，腹泻计4分)和大便出血(无计0分，隐血阳性计2分，显性出血计4分)进行计分［4］。②组织学损伤评分:取10个视野(100×)的平均评分。评分标准:正常结肠黏膜计0分，隐窝缺损1/3计1分，隐窝缺损2/3计2分，固有层覆盖单层上皮伴轻度炎性细胞浸润计3分，黏膜糜烂、溃疡伴显著炎性细胞浸润计4分。

1.4 结肠组织MCP-1表达检测 采用RT-PCR法。取各组1.2备用结肠组织提取总RNA，测定RNA纯度和含量，进行cDNA合成及DNA扩增;取5 μl PCR产物置于1%琼脂糖凝胶中80 V电压电泳25 min，将凝胶置于紫外光可见分析装置中用UVP公司(美国)图像分析系统进行扫描拍照，检测各电泳条带A值、计算MCP-1相对表达量MCP-1/GAPDH。

1.5 统计学方法 用SPSS 9.0软件进行统计分析。计量数据以±s表示，先行One-way ANOVA检验，再以SNK-q检验行组间比较。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组和模型组TNBS灌肠后1～2 d即出现与人类急性期结肠炎相似的镜下组织学表现，其中模型组3例实验期间死亡。三组DAI、组织学损伤评分及MCP-1相对表达情况见表1。

表1 三组DAI、组织学损伤评分及MCP-1相对表达比较(±s)

表1 三组DAI、组织学损伤评分及MCP-1相对表达比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，△P＜0.05

MCP-1/GAPDH组别 n DAI评分(分)组织学损伤评分(分)观察组10 0.4±0.2 1.0±0.3 1.05±0.16模型组 7 7.2±0.8* 6.2±1.0* 4.98±0.37*对照组 10 3.6±0.5＊△ 3.6±0.7＊△ 3.10±0.24＊△

3 讨论

UC以腹痛、腹泻、黏液血便、里急后重为主要临床表现［5］，病程迁延不愈，亦有发生癌变的可能［6］。流行病学资料提示，UC发病率在国内外均有逐年增加的趋势［7，8］。研究显示，参与UC发病机制的因素有免疫、遗传、环境、自由基损伤等，其中某些趋化因子起重要作用。趋化因子是一类具有趋化作用的小分子蛋白质或多肽，可作为调节因子参与机体重要的生理学和病理生理学过程及免疫应答反应，其中MCP-1因与多种疾病有关而备受关注，其最早自鼠成纤维细胞中分离出来，目前已知单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、B细胞、平滑肌细胞等多种细胞可在受刺激时诱导性分泌MCP-1，这种刺激可由IL-1、IFN-γ、PDGF等细胞因子和生长因子引起。体内外实验均证实 MCP-1可通过与其受体CCR2的作用募集单核细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞至炎症发作部位;能够触发循环中的细胞扩展变形，牢固黏附于释放选择素的血管内膜细胞表面并可介导细胞穿透血管内膜浸润至炎症局部;还可激活单核细胞和巨噬细胞，使其胞质内Ca2+浓度升高，造成超氧阴离子产生和释放，上调单核细胞和巨噬细胞黏附分子。

DG是中药甘草有效成分的第三代提取物，除具有非特异性抗炎作用外，尚有镇痛、保护膜结构、抗脂质氧化、改善肝功能及调节免疫等生物活性等作用［1，2］，特点是疗效好、无激素样不良反应，目前主要用于治疗肝炎等疾病。国内外有关其治疗UC的报道很少，且机制不明。本研究显示，观察组和模型组DAI、组织学损伤评分及MCP-1相对表达量均显著高于对照组，尤其以模型组为著。提示MCP-1表达随组织内炎症细胞功能活跃程度升高而增加，是反映溃疡性结肠炎病变程度的较好指标;DG可减轻UC大鼠结肠炎症程度。

总之，DG能减轻UC大鼠结肠炎症程度，可能机制为下调MCP-1表达。

［1］陈雄.甘草酸二铵注射液对大鼠肾缺血/再灌注损伤的保护作用［J］.时珍国医国药，2007，18(9):2197-2198.

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