HPLC法同时测定Beagle犬血浆中茴三硫及其代谢物浓度的方法学研究

余佳芮，蒋学华（1.重庆医科大学附属儿童医院，重庆市 400014；2.四川大学华西药学院，成都市 610041）

茴三硫（Anethole trithione，AT）是临床多年来常用的保肝利胆药如胆维他、新旦维等的有效成分。近年来，研究者发现该化合物还具有其他临床新用途，如促进唾液分泌、降低血脂、抗氧化作用等。但该药在进入人或动物体内后迅速代谢为对羟基苯基三硫酮（ATX）及其结合物，在血或尿中均测不到原型药物而只能测到其代谢物。鉴于AT的上述特性，考虑到在Beagle犬给药后出现类似情况的可能性较大，本文进行了Beagle犬血浆中AT及其代谢物浓度同时测定的高效液相色谱（HPLC）法的方法学考察。结果表明，该方法简便、准确、重复性好，能够满足浓度研究的要求。虽然在本文中没有对犬给药后的体内生物样品如血浆中的代谢物浓度进行测定，但本方法可为体内生物样品的分析打下基础。

1 材料

SPD-10AT HPLC仪，包括VP型泵、SPD-10AVP型紫外检测器（日本岛津公司）；ANASTAR色谱数据处理机（天津Autoscience公司）；1712型电子天平（德国Sartorious公司）。

AT对照品（四川国嘉生物制药股份有限公司，含量：99.7%）；ATX对照品（四川大学华西药学院，含量：99.8%）；甲醇和乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

Beagle犬血浆（四川大学华西药学院提供）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取AT对照品约28 mg、ATX对照品约17 mg，分别精密称定，各置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得AT（280 μg·mL－1）和ATX（176 μg·mL－1）贮备液，置于4 ℃冰箱中保存，临用时稀释至所需浓度。

2.2 色谱条件

[1，2]并经试验后确定色谱条件。色谱柱为迪马公司Diamonsil ODS C18（200 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（80∶20，V/V），柱温为40 ℃，流速为1.0 mL·min－1，测定波长为346 nm。按选定的色谱条件，取Beagle犬空白血浆、AT和ATX对照品溶液、AT+ATX对照品溶液+空白血浆进样分析，色谱见图1。

由图1可见，犬血浆中内源性物质不影响AT和ATX的分离测定，二者的保留时间分别为5.5、3.4 min。

2.3 样品处理

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.AT对照品溶液+ATX对照品溶液；C.AT对照品溶液+ATX对照品溶液+空白血浆；1.ATX；2.ATFig 1 HPLC chromatographyA.blank plasma；B.AT reference substance and ATX reference substance；C.AT reference substance+ATX reference substance+blank plasma；1.ATX；2.AT

精密量取Beagle犬血浆样品0.5 mL，加入乙腈1.0 mL，旋涡振荡3 min，10000 r·min－1离心 5 min，取上清液20 µL进样，在上述色谱条件下分离测定，分别记录色谱图、AT及ATX的峰面积，并分别用外标法计算血浆中待测物质浓度。

2.4 标准曲线的制备

精密量取犬空白血浆0.5 mL，分别加入不同浓度的含AT和ATX的对照品溶液，使犬血浆中AT的浓度分别为3.392、2.035、1.272、0.424、0.254 μg·mL－1，ATX的浓度分别为1.664、0.998、0.624、0.208、0.125 μg·mL－1，再分别加入乙腈1.0 mL，旋涡振荡3 min，10000 r·min－1离心5 min，取上清液20 µL进样，在上述色谱条件下分离测定，记录色谱图、AT和ATX峰面积。以AT和ATX的峰面积A为纵坐标，血浆中AT和ATX浓度C为横坐标进行直线回归，分别得到AT和ATX的标准曲线方程。AT：A＝34.25×103C－852.28（r＝0.9999）；ATX：A＝39.75×103C－571.09（r＝0.9998）。表明犬血浆中AT检测浓度在0.254～3.392 μg·mL－1范围内与峰面积有良好的线性关系，ATX检测浓度在0.125～1.664 μg·mL－1范围内与峰面积有良好的线性关系。最低定量浓度AT为0.254 μg·mL－1，ATX为0.125 μg·mL－1。

2.5 回收率试验

分别于0.5 mL犬空白血浆中加入高、中、低不同浓度的AT和ATX对照品溶液，混匀得到高、中、低不同浓度的AT和ATX犬血浆样品，按“2.3”项下方法处理并测定，计算出犬血浆中AT和ATX的浓度，以测得值与加入值之比分别计算两者的回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Results of recovery test（n＝5）

由表1可见，AT高、中、低浓度的平均回收率为（93.89±2.39）%，ATX高、中、低浓度的平均回收率为（96.28±2.83）%。

2.6 方法精密度

分别于0.5 mL犬空白血浆中加入高、中、低不同浓度的AT和ATX对照品溶液，混匀，得高、中、低不同浓度的AT和ATX犬血浆样品，按“2.3”项下方法处理，分别测定并计算AT和ATX的日内与日间精密度，结果见表2。

表2 精密度试验结果（n＝5）Tab 2 Results of precision test（n＝5）

由表2可见，AT高、中、低浓度的日内RSD分别为0.88%、0.83%、4.11%，日间RSD分别为0.71%、1.87%、4.51%。ATX高、中、低浓度的日内RSD分别为0.55%、0.87%、1.23%，日间RSD分别为1.74%、2.76%、3.92%。

2.7 稳定性考察

取已知浓度的含有AT和ATX的犬血浆样品数份，分别置于室温、冷冻条件下存放不同时间后，按“2.3”项下处理与测定方法操作，分别测定AT和ATX的峰面积并计算浓度，考察犬血浆样品在室温（25℃）和冷冻（－20℃）条件下分别放置6 h、6 d后的稳定性。另取不同浓度的犬血浆样品经2倍体积乙腈沉淀蛋白后的上清液，置于室温（24～27℃）下存放不同时间（6 d），测定AT和ATX的浓度，考察犬血浆样品乙腈沉淀蛋白后上清液室温下放置的稳定性。稳定性实验结果见表3。

表3 稳定性试验结果Tab 3 Results of stability test

由表3可见，犬血浆样品在室温（25℃）下放置48 h，AT不够稳定，浓度显著下降；ATX比较稳定，浓度变化小于10%。犬血浆样品在冷冻条件（－20℃）下放置6 d，AT不够稳定，浓度显著下降；ATX也不够稳定，2 d内浓度下降超过10%，2 d后浓度下降不明显。犬血浆样品经乙腈沉淀蛋白后的上清液在室温（24～27℃）下放置6 d，AT和ATX都比较稳定。

3 讨论

关于AT体内代谢方面的研究报道较少，Gmelin等[3]用14C或35S进行标记，具体研究了AT在人、家兔和鼠体内代谢的途径。在人、家兔和鼠体内，AT的Ⅰ相代谢产物相同，都是发生O-去甲基化反应代谢生成ATX。ATX继续发生Ⅱ相代谢反应生成葡萄糖醛酸结合物（ATXK2）和硫酸结合物（ATXK1）后从尿中排出。AT的Ⅱ相结合反应存在种属差异，在家兔尿中，主要以ATXK1为主，ATXK2很少；在鼠尿中，主要为ATXK2，ATXK1仅以有限量存在；而在人尿中，ATXK2作为唯一的结合物存在而没有ATXK1，此外还存在极少量未结合的ATX。

至于AT在Beagle犬体内的体内代谢，尚未见文献报道。如果与在人、家兔或家鼠体内的Ⅰ相代谢反应相同而只是在3种代谢物的数量分布上有所不同，都可以通过本方法的进一步改进（如调整流动相组成、在测定前加入相对应的水解酶水解样品等）进行测定和研究。探讨其具体可行性是笔者下一步研究的目标。

参考文献

[1]余佳芮，蒋学华，杨俊毅.HPLC测定人血浆中茴三硫浓度[J].药物分析杂志，2005，25（8）：970.

[2]丁玉峰，谢 斌.反相高效液相色谱法测定茴三硫片中茴三硫的含量[J].中国药师，2008，11（10）：1176.

[3]Gmelin R，Lagler F.Verträglichkeit und Ausscheidung von Anethotrithion[J].Arzneim Forsch，1963，13（2）：130.