环孢素A纳米粒在小鼠体内的药动学及组织分布Δ

房志刚，陈亚根，张健康，魏妙，张学农，2#（.苏州大学药学院，苏州市 2523；2.苏州利元医药科技有限公司，苏州市 25002）

环孢素A（Cyclosporine A，CyA）为第3代强效免疫抑制剂，已成功应用于肾脏、肝脏和心脏等器官移植手术前、后机体的排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，自其临床应用以来，CyA显著改善了实体器官移植的近期存活率，在器官移植史上具有划时代的意义。目前临床上常用的CyA制剂，如新山地明微乳制剂（Neoral）含有增溶剂Cremophor EL，可刺激组胺释放，引起超敏反应[1]。纳米粒给药系统以其独特的吸收机制和药物保护作用等，受到国内外科研工作者的广泛关注，并取得了较为显著的成果。因此，笔者制备了CyA纳米粒（CyANP）给药系统，所用载体材料为肠溶材料Eudragit S100。该制剂可将药物定位输送到小肠特定部位，有效减少胃肠道酶系对药物的代谢作用，并促进药物吸收，其在大鼠体内的相对生物利用度为162.1%[2]，并且由于不含增溶剂Cremophor EL，可显著降低过敏反应。

同时，由于目前国内、外文献对CyA-NP在体内组织分布的研究少有报道，大多研究其在动物体内的相对生物利用度。因此，本文以Neoral为参比制剂，对小鼠口服灌胃给药后CyA-NP在小鼠体内的药动学和组织分布做进一步研究。

1 材料

1.1 仪器与试药

LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Vivaflow50超滤仪（10000Da聚砜醚滤膜，德国赛多利斯公司）；MS3 digital涡旋器（德国IKA公司）；低速大容量多管离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器（江苏金坛市环宇科学仪器厂）；SHZ-82型恒温振荡箱（金坛富华仪器有限公司）。

CyA（批号：0608019（N），纯度：＞99.3%）、内标环孢素D（CyD，含量：＞96.5%）均由福建科瑞药业有限公司提供；Eudragit S100（德国Röhm公司）；Neoral（诺华制药有限公司，批号：S0049，规格：每粒25 mg）；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水系三蒸水。

1.2 动物

清洁级昆明种小鼠，♂，体质量18～24 g，苏州大学医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK（苏）2007-0035。

2 方法与结果

2.1 CyA-NP的制备[3]

精密量取泊洛沙姆125 mg，加入125 mL蒸馏水溶解作为水相；另取CyA50 mg、200 mg Eudragit S100，加无水乙醇50 mL制成有机相；以7#骨髓穿刺针迅速将有机相注入以400 r·min－1转速搅拌的水相中。注射完毕后继续搅拌10 min，转入60℃水浴中，搅拌3 h以挥发有机溶剂，即得CyA-NP胶体溶液，并进行相关的质量评价。

结果，CyA-NP的粒径分布为单峰分布，粒径分布范围为22～100 nm，平均粒径为（43.9±0.82）nm。包封率为（98.3±0.2）%，载药量（23.9±0.1）%，回收率（97.3±0.3）%。

2.2 生物样品中CyA的浓度测定

2.2.1 色谱条件。色谱柱：HYPERSIL-BDS C18（250 mm×4.60 mm，5 µm）；流动相：乙腈-甲醇/水＝55∶45（1/1）；流速：1.3 mL·min－1；检测波长：210 nm；柱温：70 ℃；进样量：20 μL。

在上述色谱条件下，取空白全血、含药全血+CyD、空白心脏、含药心脏组织匀浆液样品+CyD进样分析，色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白全血；B.含药全血+CyD；C.空白心脏；D.含药心脏+CyD；1.CyA；2.CyDFig 1 HPLC chromatographyA.blank blood；B.blood sample+CyD；C.blank heart；D.heart sample+CyD；1.CyA；2.CyD

图1结果表明，小鼠血液及各组织匀浆液中内源性物质基本上不干扰CyA和内标CyD的测定，处理过程未引入新的杂质，在此色谱条件下CyA和CyD达到基线分离。

2.2.2 生物样品的处理方法[4]。取小鼠心脏、肝、脾、肺、肾各组织样品，精密称定，按10 mL·g－1加水，高速电动匀浆器匀浆后，制得组织匀浆液。精密吸取全血0.5 mL或组织匀浆1.0 mL置于15 mL具塞塑料离心管中，加入20 μg·mL－1的CyD溶液50 μL和180 mmoL·L－1盐酸溶液1 mL，涡旋混合1 min，加乙醚5 mL，密塞，水平固定于恒温振荡器上，100 r·min－1振荡15 min，4000 r·min－1离心15 min；分取醚层置于15 mL具塞塑料离心管中，加入1%偏重硫酸钠2.5 mL和95 mmoL·L－1氢氧化钠溶液1 mL，振荡（4000 r·min－1）。分取无色醚层置于5 mL具塞玻璃离心管，40℃水浴中氮气吹干，残渣加乙腈-水（70∶30）150 μL，涡旋混合2 min；加正己烷1 mL，涡旋混合2 min，3500 r·min－1离心10 min，弃正己烷层，血样重复2次，组织样品重复3次，最后一次均用0.5 mL正己烷洗涤，取下层清液20 μL进样。

2.2.3 标准曲线的制备。精密吸取空白全血0.5 mL或空白组织匀浆液1 mL，加入CyA系列工作液和CyD溶液各50 μL，使成浓度依次为0.05085、0.3051、0.5085、1.017、3.051、4.068、6.102 μg·mL－1的血样及浓度依次为 0.2542、1.525、2.542、5.085、15.25、20.34 μg·g－1的组织样品，按照“2.2.2”项下方法操作，进样，记录色谱及峰面积，以Ai（CyA与CyD的峰面积之比）对浓度C作线性回归，得到线性方程，即为标准曲线，结果见表1。

表1 全血及组织中CyA的线性方程和线性范围Tab 1 Regression equation and linear rang of CyA in blood and tissues

结果表明，在相应浓度范围内，峰面积比与浓度呈良好的线性关系。

2.2.4 回收率与精密度。取空白血样0.5 mL或组织匀浆液1.0 mL，加入浓度为3、10、30 μg·mL－1的CyA溶液50 μL，按“2.2.2”项下方法操作，记录CyA与内标峰面积之比，以测得浓度与实际浓度之比计算方法回收率（%）。以生物样品中CyA的峰面积与相同浓度CyA溶液进样后峰面积之比计算提取回收率（%）。并计算日内及日间精密度（n＝5）。制备CyA在血液及各组织中的低、中、高浓度的生物样品，考察生物样本处理后室温放置12 h内的稳定性。

结果，低、中、高浓度血液和各组织样品的提取回收率均大于72%，方法回收率在78.68%～108.2%之间。血液和各组织的日内精密度小于8.6%（n＝5），日间精密度小于11.5%（n＝5）；生物样品处理后室温放置12 h内稳定，表明此方法符合生物样品分析的要求。

2.3 给药设计

取小鼠120只，随机分为20组，每组6只。实验前禁食12 h，自由饮水。前10组小鼠按25 mg·kg－1的剂量灌胃给予Neoral溶液，后10组灌胃给予等剂量的CyA-NP胶体溶液，于给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24 h摘眼球取血，置于以1%肝素抗凝的EP管中。随即颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出心脏、肝、脾、肺、肾，洗去残余血液，去除多余结缔组织，滤纸吸干，称重。所有样品均置于－70℃保存备用。

2.4 血药浓度和药动学参数的测定

应用3p97药动学处理程序，对小鼠口服Neoral和CyANP后全血的血药浓度-时间数据进行处理，确定口服给药后2种制剂均符合二室模型。Cmax、tmax为实测值，AUC采用梯形面积法计算。CyA-NP和Neoral中CyA的药动学参数结果见表2。

2.5 CyA在小鼠体内的组织分布

CyA-NP和Neoral经小鼠口服灌胃后，以不同时间各组织中CyA的含量来评价2种制剂在小鼠体内的组织分布，其小鼠各组织分布直方图见图2。

表2 2种制剂药动学参数结果（n＝6）Tab 2 Pharamacokinetic parameters of Neoral and CyANP（n＝6）

图2 2种制剂口服后在小鼠体内的组织分布（n＝6）A.Neoral；B.CyA-NPFig 2 Tissues distribution of Neoral and CyA-NP after oral administration（n＝6）A.Neoral；B.CyA-NP

由图2可见，0.5 h时CyA-NP在肝中的分布量为给药量的4.19%，在血液中的分布量为给药量的2.09%；而Neoral在肝中的分布量为给药量的4.22%，在血液中的分布量仅为给药量的1.12%。以Neoral为参比制剂，CyA-NP的相对生物利用度为162.5%。

2.6 靶向性评价

以靶向效率（Te），相对靶向效率（RTe）和靶向指数（TI）为评价指标，考察CyA-NP相对于Neoral的靶向性。由于靶与非靶组织的质量和容量相差较大，仅以AUC不能真实反映药物向不同组织分布剂量的数据，因此引入AUC与各组织质量的乘积AUQ，能更全面地定量评价药物靶向性参数，其中血液按总重的8%计算[5，6]。AUC、AUQ、Cmax和 tmax结果见表3；以Te、RTe、TI作为评价参数，结果见表4。

由表3、表4可见，CyA-NP在体内组织中药物浓度分布趋势为肝＞心脏＞肾＞脾＞肺，而Neoral为肝＞心脏＞脾＞肾＞肺；CyA-NP在体内药物量分布趋势为肝＞肾＞心脏＞肺＞脾，而Neoral为肝＞肾＞心脏＞脾＞肺；肾、心脏的相对靶向效率RTeAUC、RTeAUQ，靶向指数TIAUC、TIAUQ均大于1，而肝的靶向指数TIAUC、TIAUQ接近于1。

表3 2种制剂口服后CyA在血液及组织中的AUC、AUQ、Cmax和tmaxTab 3 AUC、AUQ、Cmaxand tmaxof CyA in blood and different tissues after oral administration

表4 2种制剂口服后CyA在血液及组织中的Te、RTe和TITab 4 Te，RTe and TI of CyA in blood and different tissues after oral administration

3 讨论

CyA系一种强亲脂性多肽，与血液中各组分都有较高的结合率，且受温度影响较大，测定时温度不易控制，故选择测定全血已成为共识。目前国内、外CyA的体内测定方法主要有放射免疫法（RIA）、高效毛细管电泳法（HPCE）、荧光偏振免疫法（FPIA）和HPLC等[7，8]。前3种方法特异性差，多因受CyA代谢物的影响而使测定结果偏高；而HPLC法特异性强，测定结果不受代谢物的影响，且测定成本相对低廉。本文采用液-液萃取法对血样及组织样品进行处理，通过2次萃取、多次洗涤等步骤，去除了生物样品中的杂质，避免了杂峰的干扰。药物的保留时间在10 min以内，有利于大量样品的测定。

与Neoral给药后比较，CyA-NP给药后改变了CyA在体内的分布，使药动学参数发生变化，其中V/f（c）变小，CL（s）降低，同时AUC明显增大，体内生物利用度是Neoral的1.625倍。这可能由于口服给药时纳米粒可被胃肠道黏附，直接被摄取，或在特定部位释放吸收所致。另外，CyA-NP的体外释药具有显著的pH值依赖性，当pH＞6时，CyA能从粒子中迅速并完全释放，这样既能减少胃肠道酶系对药物的代谢作用，又可在肠段特定部位吸收[3]。因此，在等剂量给药条件下，CyA-NP有助于药物的口服吸收。

组织分布研究结果表明，与Neoral给药后比较，CyA-NP给药后改变了CyA在小鼠体内的分布。由图2可知，2种制剂在肝中的分布量最大，其次为血液，并且CyA-NP在血液中的分布量高于Neoral。0.5 h时CyA-NP在肝中的分布量为给药量的4.19%，在血液中的分布量为给药量的2.09%，而Neoral在肝的分布量为给药量的4.22%，在血液中的分布量仅为给药量的1.12%，另外，血液靶向指数TIAUC、TIAUQ均大于1，表明CyA-NP对血液有明显的浓聚作用；在除肺外的其它组织，药物浓度达到高峰时的时间均相应提前，说明CyA-NP体内分布迅速，使血液及各组织中药物浓度较快达到峰值。

从靶向参数TeAUC、TeAUQ来看，与Neoral给药后比较，CyA-NP给药后对肾和心脏有一定的趋向性，且不会在肝中蓄积；而对于脾和肺，CyA-NP减少了CyA在这些器官的分布。

CyA-NP能够提高CyA的口服生物利用度，对肾和心脏的趋向性，预示着能够提高肾、心脏移植患者的治疗效果，并且与Neoral达到相同的治疗效果时所用剂量比较，本品的剂量更低，故可降低毒副作用，同时提高临床用药水平。

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