G蛋白抑制肽GCIP-27对小鼠心肌肥大的影响Δ

卢小岚，杨华，邓翔，刘雅，李晓辉，张海港（第三军医大学药学院药剂学教研室暨新药研究中心，重庆市 400038）

心肌肥大是高血压、冠心病、瓣膜病及先天性心脏病等多种心血管疾病的常见并发症，是心肌细胞对多种病理刺激的一种共同反应。近年来，心肌肥大作为一种引起心血管疾病发病率和死亡率显著升高的独立危险因素和重要原因[1]，引起了人们的广泛重视和高度关注，逆转心肌肥大已成为当前治疗高血压及慢性充血性心力衰竭的重要目标之一。

第三军医大学药剂教研室暨新药研究中心在既往工作中，针对在心肌肥厚发生发展过程中具有重要作用的Gq蛋白α亚单位克隆制备出一种G蛋白抑制性多肽（G protein inhibitory peptide，GCIP）[2]，并从分子结构和理化性质方面对其进行了优化设计，获得了一种能够显著抑制体外培养大鼠心肌细胞的肥大反应的优化分子GCIP-27[3]。本研究拟从整体水平观察GCIP-27对去甲肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大的作用。

1 材料与方法

1.1 试药

GCIP-27（采用固相方法合成，北京中科亚光科技公司，批号：C271401，纯度：96%）；重酒石酸去甲肾上腺素（美国Serva公司，批号：L11386，纯度：98%）；抗坏血酸（上海化学试剂采购供应站，批号：970401，纯度：99%）；酒石酸钾钠（重庆川东化工公司）；磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）和免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；抗c-Fos抗体和抗p-ERK1/2抗体（美国Santa Cruz公司）；浓缩型DAB显色试剂盒和抗体稀释液（武汉博士德公司）。

1.2 动物

健康清洁级小鼠50只，体质量（BW）20～24 g，♀♂各半，购自第三军医大学实验动物中心，动物实验合格证号：SCXK（渝）20020003。

忠诚、干净、担当是领导干部的核心素质，勇于担当，就是要有强烈的责任意识，在其位，谋其政，高标准的履职尽责。动力厂强化担当意识，推动岗位实践融入中心工作。结合“四合格四诠释”岗位实践，广大党员干部锐意进取，攻坚克难，在大项目改造、装置检修抢修、优化生产运行、节能降耗等工作中，奉献担当，用实际行动践行“四合格”，做到“五带头”，干部员工队伍奋发有为、敬业履职，圆满完成生产经营任务，不断开创各项工作新局面，推动企业发展取得新成效。

1.3 动物分组及模型建立

但是文献[12]方案中尚存在不足：没有考虑里层节点剩余能量小于能量阈值的情况以致网络节点存活率低；小车在各方环的充电时间仅考虑节点平均消耗能量，节点剩余能量的均衡性可以进一步增强.针对上述不足，本文提出一种射频能量捕获网络移动能量源均衡化充电策略，首先将区域划分为六边形网格，将六边形的中心点作为小车移动过程中的停留点，将传感器节点分层，给定能量源移动路径，基于机会路由提出一种分配小车充电时间的算法，满足相邻两层网络节点剩余能量方差最小以实现节点能量的最大均衡化需求.本文的主要贡献如下：

1.4 心肌肥大指标的测定[4]

小鼠心肌肥大指标测定完毕后，将左心室组织置于10%福尔马林中固定24 h；石蜡包埋，切片。免疫组化采用SP法。切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10 min，复合消化液消化20 min后加正常山羊血清封闭30 min。加一抗4℃过夜。次日复温至37℃、1 h，滴加二抗工作液37℃、30 min，滴加链霉卵白素37℃、30 min，DAB显色。以上步骤间均用0.01 mol·L－1PBS洗涤5 min×3次。苏木精复染，常规脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。c-Fos的表达情况用阳性细胞率表示，光镜下随机选择视野，分别计数细胞核总数与阳性细胞总数，二者比值为阳性细胞率。p-ERK1/2的表达采用真彩色医学图像分析软件（Image-proplus 4.5）进行半定量分析。所有玻片均在同一放大倍数、同一光强度下分析，测量相同面积的平均光密度值。

本文摸索了一种专业论文文本大数据的挖掘方法，采用双关键词搜索，以论文标题为源数据，经过分词、词频排序、专业论文中日常用词语料库匹配排除，得出有效专业词汇列表。再通过人工方法对专业词汇归类，归纳出各级评价因子。并对词频频率值进行统计计算，得出各评价因子权重，进而得到完整的评价体系表。

1.5 免疫组化检测[5]

末次给药后第2天，称量小鼠BW后，颈椎脱臼处死，迅速开胸取出心脏，冰冷生理盐水洗去血迹，滤纸吸干，天平称量心脏重（HW）；小心去除心房和右心室（保留室间隔），称量左心室重（LVW）；以左室重与体质量之比作为左心室指数（LVI），即心肌肥大指数；以全心重与体质量之比作为心脏指数（HI）；并计算左心室重/心脏重（LVW/HW）。

1.6 统计学方法

各组小鼠各心肌肥大指标检测结果见表1。

由表1、图1、图2可见，对照组小鼠心肌组织中很少表达c-Fos，p-ERK1/2也仅有少量表达。与对照组比较，模型组的c-Fos表达明显增强，阳性细胞率达（51.3±6.7）%；p-ERK1/2表达也明显增强（P＜0.01）。经GCIP-27处理后，3个GCIP-27剂量组c-Fos和p-ERK1/2表达量均显著减少（P＜0.01）。

2 结果

2.1 GCIP-27对小鼠心肌肥大的影响

表1 各组小鼠心肌肥大指标检测结果（）Tab 1 Determination of index of cardiac hypertrophy in mice of each group（）

表1 各组小鼠心肌肥大指标检测结果（）Tab 1 Determination of index of cardiac hypertrophy in mice of each group（）

与对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.NA group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别 剂量/μg·kg－1n BW/g HW/mg LVW/mg HI/mg·g－1LVI/mg·g－1LVW/HW/%对照组模型组GCIP-27组GCIP-27组GCIP-27组——1010301008 9 8 825.1±2.1923.2±1.6923.9±2.2423.5±2.0023.1±2.2698.8±9.68112.1±12.1＊101.0±13.398.6±18.8#95.2±5.79#70.8±8.2185.6±9.16＊＊73.4±10.2##71.3±14.6##67.9±6.30##3.95±0.314.82±0.44＊＊4.22±0.32##4.18±0.54##4.17±0.52##2.82±0.273.69±0.36＊＊3.06±0.21##3.02±0.44##2.98±0.48##71.6±.3.676.5±4.1＊72.7±2.4#72.3±4.4#71.2±30#

各组小鼠心肌组织中c-Fos和p-ERK1/2表达定量结果见表2，各组小鼠心肌组织c-Fos蛋白表达情况见图1，p-ERK1/2表达情况见图2。

取小鼠50只随机分为对照组、模型组和GCIP-27（10、30、100 μg·kg－1，剂量选取参考文献[2]）组（n＝10）。对照组给予0.1%抗坏血酸/0.003%酒石酸钾钠/生理盐水；模型组给予0.1%抗坏血酸/0.006%重酒石酸去甲肾上腺素/生理盐水（相当于去甲肾上腺素1.5 mg·kg－1）；GCIP-27组在给予去甲肾上腺素的同时，按照预实验结果，给予GCIP-2710、30、100 μg·kg－1，各组给药体积均为50 mL·kg－1，腹腔注射（ip），1日2次，连续15 d。

2.2 GCIP-27对小鼠肥大心肌组织c-Fos和p-ERK1/2表达的影响

在整个实验期间，模型组和GCIP-27低、中、高剂量组小鼠分别死亡2、1、2、2只，各组间比较无统计学差异。各组小鼠BW之间比较无显著性差异。与对照组比较，模型组小鼠HW、LVW、LVI、HI、LVW/HW均明显增加。说明在本实验条件下，应用GCIP-27各剂量后均能明显抑制小鼠心肌肥大，除低剂量组HW（减轻9.9%，但P＞0.05）外，各剂量组的其它各项心肌肥大指标均有显著改善，尤其是特异性反映心肌肥大的LVI，与模型组比较显著降低（P＜0.01）。

表2 各组小鼠心肌组织中c-Fos和p-ERK 1/2表达定量结果（）Tab 2 The quantitation expression of c-Fos and p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（）

表2 各组小鼠心肌组织中c-Fos和p-ERK 1/2表达定量结果（）Tab 2 The quantitation expression of c-Fos and p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（）

与对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.NAgroup：#P＜0.01

组别对照组模型组GCIP-27组GCIP-27组GCIP-27组p-ERK1/2表达量（光密度值）0.136±0.0180.307±0.054＊0.250±0.033#0.209±0.037#0.188±0.029#剂量/μg·kg－1n——1010301008 9 8 8 c-Fos表达量（阳性细胞率/%）2.6±3.051.3±6.7＊32.0±5.8#22.9±5.4#17.6±3.1#

图1 各组小鼠心肌组织c-Fos蛋白表达情况（免疫组化染色，×200）A.对照组；B.模型组；C.GCIP-27中剂量组Fig1 The expression of c-Fos in myocardium of mice of each group（immunohistochemical staining，×200）A.control group；B.NAgroup；C.GCIP-27 middle dose group

图2 各组小鼠心肌组织p-ERK1/2表达情况（免疫组化染色，×200）A.对照组；B.模型组；C.GCIP-27中剂量组Fig 2 The expression of p-ERK1/2 in myocardium of mice of each group（immunohistochemical staining，×200）A.control group；B.NAgroup；C.GCIP-27 middle dose group

2.2 乳酸水平比较 入组时两组患者间乳酸水平相似，分别为(6.31±0.78) mmol/L和(6.13±0.62) mmol/L，差异无统计学意义(P>0.05)。经过治疗后两组乳酸水平均有下降，且实验组下降得更为明显，到治疗后第1 d、第3 d两组乳酸水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

3 讨论

心肌肥大主要是心肌细胞体积增大的结果，即直径增宽，长度增加；同时，心肌细胞内蛋白质含量增加，DNA、RNA以及蛋白质合成加强，所以心肌总量很快增长，导致整个心脏重增加，尤其是左心室重增加显著。虽然心肌肥大早期有一定的代偿作用，但增生的心肌组织最终造成心肌供血供氧不足，能量生成减少，心肌收缩性减弱。

So L5=950×I6+475+475-200=950×I6+750,L6=Ls-A1-A2-220-200-(950×I6+750)=Ls-A1-A2-950×I6-1 170

c-Fos是一种DNA结合蛋白，在核内起信使作用，将膜信号引发的胞浆事件与核内的基因活动联系起来；与心肌细胞的生长、发育亦密切相关，在胚胎期心肌表达较高，出生后1周便消失。当心肌负荷增加或促心肌生长因素刺激时，早期常伴有c-Fos等原癌基因产物的有序表达，而后才出现心肌肥大[6]。c-Fos是组成由细胞表面刺激到出现相应的细胞效应的信息传递链的成分，在心肌肥大的反应中起着一种允许作用，促进心肌细胞蛋白质的合成。ERK（Extracellular signal regulated kinase）是一族分子量为40～60 KD的蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶，可对许多细胞外刺激发生反应而被快速激活。p-ERK1/2是ERK1/2的活化形式，ERK1/2活化为p-ERK1/2后，转位入核，可磷酸化一系列转录因子和核蛋白，如c-Fos、c-myc、STAT等[7]，促进细胞的增殖和分化。

在心肌肥大的发生过程中，鸟苷酸结合蛋白Gq蛋白处于枢纽地位，去甲肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、内皮素-1、神经肽Y等通过其相应的受体与Gq蛋白相偶联[8]。Gq活化后，激活磷脂酶C，继而催化磷脂酰肌醇-4、5-二磷酸（PIP2）水解生成1，4-三磷酸肌醇与二酰基甘油，前者引起细胞内Ca2+释放，后者激活蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）。PKC与调控细胞增殖、分化有关，能促进多种蛋白质分子中丝氨酸或苏氨酸残基发生磷酸化反应，促进基因表达，刺激细胞的增殖，是肥大信号传递的共同通路之一，在肥大反应的发生、发展中发挥重要作用。

GCIP-27是Gq蛋白α亚单位的蛋白羧基末端模拟肽，通过与受体结合阻碍鸟氨酸调节蛋白Gα蛋白分子效应，从而拮抗多种受体激动剂的功能，具有比拮抗单一受体更强的作用。本实验室既往研究发现，合成肽GCIP-27能明显减小去甲肾上腺素或血管紧张素Ⅱ刺激的体外培养心肌细胞的直径、细胞内蛋白质含量和蛋白质合成速率。本实验发现，GCIP-27能够明显减小去甲肾上腺素所诱导的小鼠心肌肥大，抑制心肌组织中p-ERK1/2表达，降低原癌基因c-Fos表达。说明GCIP-27不仅能在体外抑制心肌细胞的肥大反应，在整体情况下同样具有显著的抗心肌肥大作用，具有良好的开发应用前景。

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