黄芩苷与盐酸小檗碱在大鼠小肠吸收的相互作用研究Δ

杜青青，王战国，刘芳，蒋学华（四川大学华西药学院，成都市 610041）

口服给药是中药复方临床应用最常用的给药形式，吸收是中药复方发挥临床效应的前提。中药有效成分之间的相互作用[1]已成为大家关注的焦点，而复方制剂肠吸收相互作用又与临床疗效密切相关。笔者以泻心汤药效成分黄芩苷、盐酸小檗碱为研究对象，采用大鼠原位灌注模型进行其肠吸收相互作用初步研究[2]，以期为泻心汤药效成分配伍[3]体内药动学相互作用研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-2010C HT型高效液相色谱（HPLC）仪（日本Shimadu公司）；Votex Genius 3型旋涡混合仪（德国IKA公司）；恒温水浴锅（上海医疗设备总厂）；Anke TGL-16C型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药

黄芩苷对照品（批号：110715-200514）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-200609）由中国药品生物制品检定所提供；酚红标准品（天津科密欧化学试剂开发中心，批号：20040111）；黄芩苷提取物（批号：060812，含量≥98%）、盐酸小檗碱提取物（批号：060204，含量≥95%）由四川升和制药有限公司提供；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

SD大鼠，♂，体质量（200±20）g，购自四川大学实验动物中心（动物合格证号：川实动管质第10号）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 Kerbs-Ringer溶液（KR溶液，pH 7.4）：称取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO40.32 g、MgCl20.02 g、葡萄糖1.40 g，加水定容至1 L。

2.1.2 酚红KR溶液：取酚红20.1 mg，精密称定，KR溶液（含0.2%Vit C）稀释定容至1 L。

2.1.3 空白肠循环灌注液：将KR溶液（含0.2%Vit C）照大鼠原位肠循环灌注法循环3 h，中止实验，即得空白肠循环灌注液。

2.1.4 混合对照品溶液：取黄芩苷对照品10.24 mg、盐酸小檗碱对照品11.80 mg和酚红标准品5.00 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，4℃贮藏，作为混合对照品溶液。

2.1.5 黄芩苷供试品溶液：分别取黄芩苷提取物31.42 mg、酚红标准品20.1 mg，精密称定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀释定容至1 L。

2.1.6 盐酸小檗碱供试品溶液：分别取盐酸小檗碱提取物10.10 mg、酚红标准品20.1 mg，精密称定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀释定容至1 L。

2.1.7 混合供试品溶液：分别取黄芩苷提取物31.5 mg、盐酸小檗碱提取物10.02 mg、酚红标准品20.10 mg，精密称定，用KR溶液（含0.2%Vit C）稀释定容至1 L。

2.2 大鼠小肠吸收实验设计

选实验前禁食12 h（自由饮水）的SD大鼠15只，随机分成3组，分别用“2.1”项下“黄芩苷供试品溶液”、“盐酸小檗碱供试品溶液”和“混合供试品溶液”进行实验。将大鼠ip戊巴比妥钠（40 mg·kg-1），麻醉后固定。沿腹中线打开腹腔（2～3 cm），结扎胆管，于十二指肠上部和回盲肠末端各切一小口，在上端小口处插入直径为0.3 cm的玻璃管，并用线扎紧。用注射器将37℃的生理盐水缓缓注入肠管，洗去肠管内容物至净，然后在实验肠管下端小口处插入玻璃管，并用线扎紧。将肠管两端的玻璃管与蠕动泵的胶管连接，形成回路，开动蠕动泵。肠灌注液以5 mL·min-1流速循环10 min后，将流速调节为2.5 mL·min-1，立即自灌注液锥形瓶中取样0.4 mL，同时向锥形瓶中补加酚红KR溶液0.4 mL，其后每隔15 min亦按同法取样并补加酚红KR溶液，循环3 h后中止实验。

2.3 样品检测

取循环样品供试液0.4 mL，用甲醇0.8 mL稀释，混旋1 min，15000 r·min-1离心5 min，取上清液10 μL进样，记录色谱图，用回归方程计算肠循环液中黄芩苷和盐酸小檗碱的浓度。

2.4 统计学方法

采用SPSS 13.0中的Indepent-Samples t Test检验，考察黄芩苷、盐酸小檗碱单独给药以及配伍后各组的吸收速率常数（ka）和吸收率（A）是否有统计学差异。

2.5 黄芩苷、盐酸小檗碱和酚红HPLC测定方法

2.5.1 色谱条件：色谱柱为Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水-磷酸-三乙胺（30∶70∶0.2∶0.1），柱温为30℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为270 nm。

2.5.2 专属性考察：分别取空白肠循环灌注液、混合对照品溶液、混合肠循环灌注液，按“2.5.1”项下色谱条件进样10 μL，测定。结果表明，酚红、黄芩苷和盐酸小檗碱的保留时间分别为4.6、6.9和10.2 min；供试液中其它成分不干扰测定。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白肠循环灌注液；B.混合对照品溶液；C.混合供试品溶液；1.酚红；2.黄芩苷；3.盐酸小檗碱Fig 1 HPLC chromatogramA.blank circumfusion solution；B.circumfusion control；C.circumfusion sample；1.phenolsulfonphthalein；2.baicalin；3.berberine

2.5.3 线性关系考察：倍数稀释法配制混合对照品系列标准工作液，按“2.5.1”项下色谱条件进样10 μL。以峰面积积分值（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得黄芩苷的回归方程为A＝28243.76C－40.01（r＝0.9999），线性范围为1.60～102.40 μg·mL-1；盐酸小檗碱的回归方程为 A＝41317.40C+2059.40（r＝0.9999），线性范围为1.84～118.00 μg·mL-1；酚红的回归方程为A＝14424.71C－203.54（r＝0.9999），线性范围为3.13～50.00 μg·mL-1。

2.5.4 精密度试验：（1）分别吸取低、中、高浓度的混合对照品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样10 μL，根据回归方程计算各溶液浓度。结果，高、中、低浓度黄芩苷、盐酸小檗碱和酚红日内RSD分别为0.13%、0.18%、0.22%；0.24%、0.22%、0.14%；0.80%、0.64%、0.93%。（2）分别在1、2、3 d吸取高、中、低浓度的混合对照品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样10 μL，根据回归方程计算各样品浓度，高、中、低浓度黄芩苷、盐酸小檗碱和酚红日间精密度分别为0.23%、0.12%、0.18%；0.19%、0.12%、0.17%；1.25%、1.11%、0.69%。结果表明，3个组分的日内、日间精密度均良好。

2.5.5 稳定性考察：黄芩苷、盐酸小檗碱与酚红在含有Vit C的KR溶液（37℃）中3 h内稳定，在甲醇处理后的样品溶液中24 h内稳定。

2.5.6 回收率试验：取不同体积混合对照品贮备液，置于10 mL容量瓶中，用空白KR液-甲醇（1∶2，V/V）稀释至刻度，摇匀，得高、中、低浓度的对照品工作液。按“2.5.1”项下色谱条件进样10 μL，测定，以测定浓度与加入浓度之比计算回收率。结果，高、中、低浓度黄芩苷回收率分别为（100.61±0.22）%、（99.49±0.18）%、（99.30±0.13）%；高、中、低浓度盐酸小檗碱回收率分别为（99.68±0.14）%、（99.83±0.22）%、（100.84±0.24）%；高、中、低浓度酚红回收率分别为（97.53±0.67）%、（98.17±1.08）%、（98.90±1.23）%。

2.6 黄芩苷与盐酸小檗碱配伍前后大鼠小肠吸收动力学特征

黄芩苷在配伍盐酸小檗碱前、后的ka具有显著性差异（P＜0.05），但其A无显著性差异；盐酸小檗碱在配伍黄芩苷前、后的ka和A均有显著性差异（P＜0.05）。黄芩苷与盐酸小檗碱配伍研究中大鼠小肠吸收动力学特征见表1。

表1 黄芩苷与盐酸小檗碱配伍研究中大鼠小肠吸收动力学特征（，n＝5）Tab 1 Absorptive kinetics characteristics of rats’small intestine in study of compatibility of baicalin and baicalein（，n＝5）

表1 黄芩苷与盐酸小檗碱配伍研究中大鼠小肠吸收动力学特征（，n＝5）Tab 1 Absorptive kinetics characteristics of rats’small intestine in study of compatibility of baicalin and baicalein（，n＝5）

与配伍前黄芩苷组比较：＊P＜0.05；与配伍前盐酸小檗碱组比较：#P＜0.05vs.baicalin perfused alone group：＊P＜0.05；vs.berberine perfused alone group：#P＜0.05

配伍前后配伍前A/%5.92±1.393.47±0.644.27±1.235.18±0.83#配伍后黄芩苷盐酸小檗碱黄芩苷盐酸小檗碱成分 参数ka/h-1 0.068±0.0020.044±0.0030.060±0.002＊0.057±0.006#

3 讨论

研究结果表明，盐酸小檗碱可以抑制黄芩苷的小肠降解或吸收；黄芩苷可以促进盐酸小檗碱的小肠吸收。黄芩苷在吸收前有代谢与降解反应[4，5]发生，故不能将药量减少计算出来的ka作为黄芩苷的小肠吸收常数，而应该是肠道代谢、降解和吸收的共同作用。此过程较为复杂，本研究只对其配伍之后产生的总体结果进行了分析，若要研究黄芩苷的肠道代谢、降解和吸收机制，还需要进一步研究。

研究中黄芩苷和盐酸小檗碱配伍应用，黄芩苷的降解或吸收受到抑制，可能对其吸收和代谢均具有一定作用，此时黄芩苷在小肠中的停留时间增长，进入血液的量减少，对其药效作用的发挥可能产生影响，推测黄芩苷在肠道内的存在时间延长与其药效的发挥之间存在一定关系，这些有待进一步的科学实验进行论证。研究证实，盐酸小檗碱配伍黄芩苷后的吸收速率与量均发生变化，这可为泻心汤药效成分配伍吸收过程中的相互作用研究提供参考。

[1]肖春芬，周 莉，娄兆文.国内有关数种中药有效成分间相互作用的研究现状[J].中国药房，2007，18（15）：32.

[2]刘太明，蒋学华，张梅娟，等.黄芩苷和黄芩素的大鼠在体肠吸收特性[J].中国药学杂志，2006，41（23）：1784.

[3]鲁佳慧，江 滨，曾元儿.中药配伍的研究进展[J].时珍国医国药，2003，14（7）：419.

[4]Pieter B，Armorel DE.Comparative in vitro permeability of human vaginal，small intestinal and colonic mucosa[J].Int J Pharm，2003，261（1）：147.

[5]Parvin ZM，Mohammad BJ，Hosniyeh T，et al.Simultaneous determination of naproxen，ketoprofen and phenol red in samples from rat intestinal permeability studies：HPLC method development and validation[J].J Pharmaceut Biomed，2005，39（3）：624.