归芍清血合剂质量标准研究

归芍清血合剂由生地黄、赤芍、当归、金银花、黄芩等九味中药组成。本品清热解毒，凉血止痛，临床用于皮肤过敏、瘙痒等症。为有效地控制制剂质量，本实验建立了赤芍、当归、金银花、黄芩的薄层色谱鉴别方法，并采用HPLC法测定君药赤芍的主要成分芍药苷的含量。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent 紫外检测器，Agilent色谱化学工作站；Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。XS-104型分析天平(瑞士梅特勒)；芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，110736-200527)，阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110773-200611)，绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110753-200413)， 黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110708-200205)；归芍清血合剂及阴性对照品(本院自制)；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，水为注射用水。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 当归的薄层鉴别 取本品20ml，加乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液(水液备用)，挥干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取阿魏酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。再取不含当归的空白样品，按供试品溶液制备法制成阴性样品溶液。分别吸取上述三种溶液各5 μl， 点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷- 乙酸乙酯-甲酸(25∶12∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点，阴性无干扰。

2.1.2 赤芍的薄层鉴别 取“2.1.1”项下乙醚提取后的水液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，正丁醇液蒸干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1 ml含2 mg的溶液，作为对照品溶液。再取不含赤芍的空白样品，按供试品溶液制备法制成阴性样品溶液。分别吸取上述三种溶液各5μl， 点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。

2.1.3 金银花的薄层鉴别 取本品20 ml，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 ml，合并提取液，浓缩至0.5 ml，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取不含金银花的空白样品，按供试品溶液制备法制成阴性样品溶液。分别吸取上述三种溶液各10 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(14∶5∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。

2.1.4 黄芩的薄层鉴别 取本品10 ml，加稀盐酸2滴，用乙酸乙酯提取2次，每次10 ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取不含黄芩的空白样品，按供试品溶液制备法制成阴性样品溶液。分别吸取上述三种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。

2.2 芍药苷的含量测定

2.2.1 色谱条件及系统适应性考察 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(20∶80)，检测波长230 nm，柱温：30℃；进样量：20 μl。在此色谱条件下，供试品及对照品溶液在相同保留时间处有吸收峰，而阴性对照溶液在相应位置无吸收峰，阴性对照品对检测无干扰，理论塔板数按芍药苷峰计不低于10000。见图5～7。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品2.4 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。取此液加甲醇稀释成含芍药苷0.024 g·L-1的溶液， 作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液及阴性对照溶液的制备 精密量取本品2 ml，置50 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取上清液，滤过，精密吸取续滤液2 ml， 置10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，作为供试品溶液；取按处方量除去赤芍制成的阴性对照品，依照供试品溶液的制备方法所得溶液为阴性对照溶液。

2.2.4 线性关系考察 取0.24 g·L-1的芍药苷溶液，依次加甲醇稀释为0.024、0.016、0.008、0.004、0.002 g·L-1的溶液，各取20 μl分别进样，以芍药苷进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，计算得回归方程y=2079.8897x+5.1831，r=0.9994。

结果表明，芍药苷进样量在0.04～0.48 μg范围内有良好的线性关系。

图1 当归薄层鉴别色谱图

图2 赤芍薄层鉴别色谱图

图3 金银花薄层鉴别色谱图

图4 黄芩薄层鉴别色谱图

2.2.5 精密度试验 供试品溶液，重复进样6次，每次进样20 μl， 按上述色谱条件测定峰面积，计算RSD为0.65%。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温避光保存，分别于配制后0，2，4，8，12，24小时进样20 μl测定计算，结果RSD为0.78。

2.2.7 重复性试验 取同批样品(070801)6份，分别按样品测定方法测定，计算样品中芍药苷的平均含量为0.797 mg·ml-1，RSD为1.02%。

2.2.8 回收率试验 精密量取已知含量的样品溶液(批号 070801)6份各1.0 ml，置50 ml量瓶中，分别精密加入0.32 g·L-1的芍药苷对照品溶液2.0，2.0，2.5，2.5，3.0，3.0 ml，按“2.2.3”项下的方法制备，在上述色谱条件下测定，计算回收率，结果见表1。

图5 芍药苷对照品

图6 样品

图7 阴性对照

表1回收率实验结果(n=6)

样品含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0．7970．641．40494．840．7970．641．43199．060．7970．801．56796．2597．131．180．7970．801．57397．000．7970．961．74498．650．7970．961．72896．98

表2 样品测定结果

2.2.9 样品测定 取归芍清血合剂样品3批，按“2.3”项下供试品溶液的方法制备后分别进样3次，计算，结果见表2。

3 讨论

薄层鉴别参考有关文献[1-2]，赤芍经水饱和的正丁醇提取后，薄层色谱斑点较清晰；样品溶液经盐酸处理后用有机溶剂提取，鉴别黄芩苷，方法简便，重现性好。

赤芍有清热凉血作用，为方中主要成分，因此选择芍药苷作为含量测定指标，参考有关文献[3-6]，分别以甲醇和稀乙醇提取样品，结果以甲醇超声提取30分钟结果最好，因此选择甲醇为提取溶剂。

本文建立的薄层鉴别和含量测定方法简便、准确，重复性好，为归芍清血合剂的质量控制提供了依据。

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