免疫介导再生障碍性贫血动物模型的建立

卢 玮,陈国安

(南昌大学第一附属医院血液科,南昌 330006)

再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA),是一种获得性的骨髓造血功能衰竭综合征。主要表现为骨髓造血功能低下,全血细胞减少和贫血、出血、感染。其发病机制尚不明确。虽然一些AA的病例是继发于理化致病因子的接触,但大部分的病例是特发性的。随着研究的深入,AA免疫学机制的异常成为了研究的热点。而大部分的病例对免疫抑制剂治疗有效也提示免疫异常为AA发生发展的一个重要环节。

AA免疫异常主要表现在T淋巴细胞功能异常[1]和IFN-γ、T NF-α等造血负调控因子的分泌异常[2]。根据人类AA发生过程复制出相似的动物模型将对学者深入了解AA的免疫学发病机制,指导免疫治疗起到很大的帮助。本文将对免疫介导建立的动物模型作一综述,根据其诱导方法的不同分为病毒感染和淋巴细胞输注。

1 病毒感染介导动物模型建立

持续的病毒感染可以使得机体免疫系统在清除病毒过程中发生异常而导致骨髓的衰竭。早在1955年就有肝炎并发AA的报道。随后陆续发现可能与AA发病有关的病毒,还有巨细胞病毒(CMV)、人类微小病毒B19、EB病毒、登革热病毒及艾滋病病毒(HIV)等[3-7]。

Mayer A.等[4]建立了“巨细胞病毒相关 AA(CMV-AA)”的动物模型,用巨细胞病毒持续感染小鼠,出现重要骨髓网状间质细胞的缺失及功能的损害。同时检测到编码必需的造血因子粒细胞集落刺激因子(CSF)和白介素-6的基因表达下降。人在感染了巨细胞病毒后也常常伴随暂时性的中性粒细胞和血小板的减少,可能是由于病毒的感染干扰了骨髓间质细胞的功能而导致造血因子的生成减少。人类微小病毒B19也可以特异性地选择抑制红系造血,出现暂时的红系造血停滞。而体液免疫缺陷患者会因为病毒的持续存在而发生纯红细胞AA,慢性溶血性病人则会因为红系造血受抑制而发生AA 危象[5]。

病毒引起的AA病例有CD8+T细胞增加,CD4+T细胞减少,CD4+/CD8+T细胞比例失调,导致CD4+T细胞对造血的刺激活性下降。用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)持续感染小鼠也表现出T细胞对造血的抑制活性增加[6]。Binder D.等[7]用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)持续感染缺乏穿孔素的小鼠,小鼠表现出了强烈的T细胞反应,但是不能清除病毒。通过14 d的持续感染后,这些小鼠出现进行性的全血细胞减少,最终因粒细胞缺乏和血小板减少而死亡。主要效应细胞为CD8+T细胞。这种LCMV-AA小鼠模型与人血清阴性肝炎病毒感染后AA表现出一些共同的血液学和免疫学的特征。同样是用LCMV感染 2种CBA/Ht和C3HeB/FeJ小鼠,虽然都产生相同的贫血症状,但是发生贫血的机制确有所不同。提示小鼠的品系可能会对同一病毒感染介导的AA产生影响[8]。

2 淋巴细胞输注介导动物模型建立

类似移植相关的移植物抗宿主病(GVHD)的免疫机制,当供者血液中的淋巴细胞渗入到易感受者的体内会引起骨髓增生不良,这使得淋巴细胞输注诱导AA具有可行性,现在也是最常用的造模方法。最早利用此方法诱导小鼠AA的是在1967年,Barnes D.W.等[9]给照射6 Gy的CBA/H小鼠1×107个C3H/He小鼠的淋巴结细胞,AA发生率为63%,发病时间在18～70 d。姚 军等[10]用照射6 Gy的BALB/c小鼠输DBA/2小鼠的胸腺淋巴结混合细胞来诱导AA,发生率达到96.2%,发病时间为8～14 d。但由于模型小鼠在短时间就全部死亡,推测由于射线剂量过大,故现常用5.5 Gy的剂量处理小鼠。

将正常亲代小鼠的淋巴细胞输注到杂交第一代小鼠体内也可以诱导AA,经过和未经过非致死剂量照射的子代小鼠会在2～3个星期内发生致命性的全血细胞减少[11-12]。但经过照射所建立的模型更加符合人类AA的发病特点。对AA小鼠的骨髓进行检查,发现AA小鼠的骨髓腔基本上空了。在骨髓衰竭小鼠的残余骨髓细胞中含有大量供体小鼠的T细胞浸润及Fas表达的上调。在进一步的移植实验中,这些残余的骨髓细胞可以破坏正常小鼠的骨髓造血干细胞及间质细胞,被称为“旁观者的破坏效应”[12]。AA小鼠血清中IFN-γ的浓度相比对照组增加了2～3倍,用抗T NF-α抗体则能提高受者小鼠的存活率。A A患者外周血T淋巴细胞可分泌过量的IFN-γ,IFN-γ主要是通过阻止细胞周期进行抑制造血。此外IFN-γ和T NF-α均可上调CD+34细胞上的Fas受体,通过Fas/FasL增强细胞对凋亡的敏感性,诱导造血干(祖)细胞过度凋亡[13]。Risitano A.M.等[14]通过实验发现AA患者有多种异常的TCRVβ亚家族的优势扩增,形成寡克隆T细胞亚群。而在Chen J.等[11]复制的模型中表现出了供者的T淋巴细胞在受者体内寡克隆的特点,从而可以进一步研究这种异常扩增的寡克隆T淋巴细胞是否参与了AA的免疫学发病。因为在接受亲代淋巴细胞输注的子代小鼠没有发生移植物抗宿主现象,Chen J.等[15]将小鼠的淋巴结细胞输入到经非致死剂量照射的主要组织相容性抗原(MHC)不相合的小鼠体内,2～3个星期后同样建立AA模型。AA小鼠血清中的CD8+T细胞异常增多,并在10～12 d内达到顶峰。

近来研究发现,AA患者末梢血中的T h1细胞转录因子T-bet表达上调[16]。T ang Y.等[17]分别用T-bet基因敲除小鼠和未敲除小鼠的淋巴细胞与MHC不合的小鼠的骨髓细胞混合进行培养,发现T-bet-/-淋巴细胞的骨髓细胞毒性缺陷;而接受T-bet-/-淋巴细胞输入的受者小鼠骨髓中的CD4+和CD8+细胞及IFN-γ水平要比T-bet+/+组低且跟对照组相近。这个动物模型也证实了T-bet在AA的发病过程中扮演着重要角色。除此之外,T-bet与疾病活动和免疫抑制治疗疗效有关。经免疫抑制治疗,获得缓解的AA患者T-bet表达降低,与正常对照者相比差异无显著性,但疾病复发时,T-bet表达再度升高[18]。

随着对AA发病机制的研究深入,T-bet表达增高是由于调节性T细胞调节缺陷所致。调节性T细胞主要分CD4+CD25+、CD8+CD28-两类,它们可通过分泌细胞因子,或通过与其他T细胞或抗原递呈细胞的直接接触发挥其免疫抑制作用。CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)具有独特的免疫调节作用,其功能的缺失可导致多种自身免疫性疾病的发生[19]。Foxp3是CD4+CD25+调节性T细胞发育和功能维持的关键性调节基因,其特异性地表达于CD4+CD25+调节性T细胞[20]。而在绝大部分的AA患者里,CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞是减少的[21]。在MHC相合但是次要抗原不合介导的小鼠AA模型中也证实恢复Treg的功能是可以改善骨髓衰竭的情况[22],提示输入调节性T细胞AA来说可能是一种有效的细胞疗法。

综上所述,AA存在着复杂的免疫学反应异常。T细胞通过细胞毒性及其释放的抑制性细胞因子,直接抑制造血或经凋亡导致骨髓衰竭。通过病毒感染和淋巴细胞输入等免疫介导的方式可以诱导出AA动物模型,此类模型具有复制成功率高、稳定性好的特点。并且还能和人类AA表现出相似的病理生理过程,使得研究者可以动态观察病情发展,更好地了解发病机制。AA动物模型的建立更是为治疗药物的研发和新的治疗方法的研究提供了平台。

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