EB病毒潜伏膜蛋白LMP-1在鼻咽癌中的表达及临床意义

林 锦 郭巧娟 韩 露 陈奇松 宗井凤 潘建基 林少俊

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是1种人类致瘤性DNA疱疹病毒，与鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)发生密切相关。潜伏膜蛋白1(latentmembrane protein-1，LMP-1)是EB病毒编码产物中被证实具有癌基因功能的蛋白质之一，现已证明其可通过一系列复杂的调节机制抑制细胞凋亡，促进细胞无限制增生，可能在鼻咽癌的发生、发展过程中起关键作用。本研究采用PCR方法，检测鼻咽癌患者鼻咽拭子中LMP-1的表达情况，分析LMP-1与NPC临床病理特征的相关性，以为LMP-1应用于诊断及靶向性治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2007～2008年福建省肿瘤医院放疗科收治的经病理检查确诊的鼻咽癌初诊患者129例，中位年龄46岁(14～77岁)，男性92例，女性37例。入组患者均在治疗前接受超声及影像学检查，并在“鼻咽癌2008分期”发表后对所有患者重新分期:T12例，T233例，T351例，T443例;N012例，N117例，N287例，N313例;M0122例，M17例。Ⅰ期0例，Ⅱ期10例，Ⅲ期62例，Ⅳ期57例。病理类型:角化型癌28例，非角化型癌101例。所有入组对象均告知试验的目的和可能存在的风险，征得同意并签署知情同意书。

1.2 仪器和试剂

PCR仪(BIO-RAD公司产品)，DNA试剂盒(QI-GEN公司产品)，DNA聚合酶(TAKARA公司产品)，Marker(上海博鸿公司产品)，贝克曼高速冷冻离心机(Sigma公司产品)，CO2培养箱(Thermo公司产品)，紫外投射分析仪(上海康禾光电仪器有限公司产品)，B95-8细胞株来自我院放射生物学实验室。

1.3 鼻咽拭子标本采集

具体方法见参考文献［1］，若未提取到足够的DNA用于PCR检测，则重复采集。

1.4 DNA 提取

具体方法见参考文献［1］。

1.5 PCR法检测LMP-1基因

于微量离心管中混合下列反应体系:5μL提取DNA，20μmol/L上游和下游引物(BN1为 5’-AGCGACTCTGCTGGAAATGAF-3’，BN2 为 5’-TGATTAGCTAA GGCATTCCCA-3’)各 1 μL，2.5 mmol/L dNTP(脱氧三磷酸核苷)5 μL，10×PCR MIX 5 μL，0.25μL单位耐热DNA聚合酶(含1.25 U)，加无菌水至50μL。PCR程序:95℃预变性5 min，热循环:35个循环，94℃变性30 s、50℃退火30 s，72℃延伸60 s。最后72℃延伸10 min，4℃保存。琼凝胶电泳，溴乙锭染色显影DNA，所使用的DNA marker为上海博鸿公司产品，PCR产物在胶上显示位于100 bp与1 000 bp间，符合实验的设想，说明所得的条带为Lmp-1，另以B95-8细胞提取的DNA经PCR检测的阳性条带作为阳性对照，无菌水反应作为阴性对照。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件处理，行 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽拭子中LMP-1表达情况

试验组129例中114例LMP-1呈阳性表达(88.37%)。经PCR法检测LMP-1阳性表达的条带见图1，maker在100～1 000 bp，约在290 bp处可见清晰的扩增条带。

图1 PCR法检测LMP-1基因的表达

2.2 LMP-1表达与鼻咽癌临床病理特征的关系(表1)

LMP-1表达与鼻咽癌患者性别、年龄、T分期、临床分期无显著相关性(P＞0.05)。N0期与 N1～3期比较LMP-1阳性表达率差异具有显著性(χ2=9.7925，P＜0.05)。远处转移组与无远处转移组LMP-1阳性表达率差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 LMP-1表达与鼻咽癌临床病理特征的关系(例)

3 讨论

EB病毒是1种具有致瘤潜能的DNA疱疹病毒，其基因产物有3种潜伏性膜蛋白 (LMP1、LMP2A和LMP2B)，其中LMP-1是1984年在 EB病毒转化的B淋巴细胞中发现的含量最丰富的病毒产物，其生物学功能具有多效性，Wang等研究发现，LMP-1表达会使鼠成纤维细胞Rat-1细胞的形态学发生变化，导致细胞无限制增殖，细胞间失去接触抑制，并发生恶性转化［2］，此后大量研究还表明其可恶性转化原代B细胞和人上皮细胞，而被列为癌基因。

近年来，对LMP-1的生物学研究还表明，其可以促进EB病毒阳性的鼻咽癌细胞转移。体内外研究中应用RNA干扰技术，抑制鼻咽癌细胞中LMP-1基因的表达，使细胞的贴壁生长能力大大提高，基膜穿透能力和细胞移动能力明显下降，提示LMP-1基因可影响鼻咽癌细胞的转移潜能［3～5］。

文献报道采用免疫组化方法，检测鼻咽活组织中LMP-1的表达，发现LMP-1的阳性表达率在43% ～72.5%［6～12］。我们采用PCR 法检测鼻咽拭子中 LMP-1基因的表达，阳性表达率为88.37%，明显高于免疫组化法［6～12］。进一步分析发现淋巴结阳性组(N1～3)LMP-1阳性表达率明显高于淋巴结阴性组(N0)，差异有显著性，与文献报道的一致［6～9］，进一步验证了LMP-1与鼻咽癌转移有关的论点。但有研究者认为，LMP-1的表达水平在鼻咽癌不同N分期之间的差异无统计学意义［10，11］，考虑可能与这两个研究中样本量较小有关(分别为40例及38例)。

有学者对LMP-1与远处转移的关系进行分析，发现LMP-1表达与远处转移显著相关［7］，故若能在患者初诊时做LMP-1的检测就可以预测鼻咽癌患者的转移潜能，指导临床制定个体化的治疗方案，提高鼻咽癌的生存率，做为随访及评价预后的指标之一，并为LMP-1用于抗肿瘤转移的靶向治疗提供依据。本实验首诊无远处转移(M0)患者122例中有107例LMP-1呈阳性表达，表达率为87.70%，而另外首诊有远处转移(M1)的7例患者LMP-1均呈阳性表达，表达率为100%，高于M0组，但是无统计学差异，与文献报道的相反［7］。考虑可能原因为在我们的入组患者中多为早中期患者，考虑有部分转移机率高的患者在出现远处转移前就诊，有待于今后进行更大规模的试验明确。

LMP-1引起肿瘤转移的机制尚不是很明确，现有研究表明，LMP-1 可以通过诱导 C-Met、Twist、MMP-9、DcR3、Ezrin、COX-2 原癌基因的表达［8，11，13～16］，进而改变肿瘤细胞极性及细胞运动、调节肿瘤细胞间黏附及细胞与细胞外基质黏附，在肿瘤转移过程中发挥重要作用。LMP-1还通过激活DNMT1，3A and 3B引起细胞黏附分子E-钙黏蛋白启动子的甲基化进而导致E-钙黏蛋白的表达减少，使表达LMP1的上皮细胞具有更高的转移潜能［17］。再者，LMP-1可以上调HIF-1的表达水平，进而促进 HIF-1下游促转移基因的表达［18］。肿瘤转移与血管形成密切相关，研究还发现LMP-1 与瘤内的血管形成密切相关［6，7］，LMP-1 可以通过STAT3调控VEGF的表达，引起肿瘤新生血管增多、通透性增大，促进淋巴结转移的可能性［19］，LMP-1还可以通过调节EGFR的表达及通过NF-κB介导的信号转导途径，反向激活糖基化终末产物受体(RAGE)基因而影响肿瘤新生血管的形成［9，20，21］。

LMP-1表达与鼻咽癌其他临床病理参数是否有关，目前研究报道未完全一致。我们发现LMP-1表达与鼻咽癌患者的临床分期无关，与部分报道的一致［8，11，12］，但姜武忠等认为晚期鼻咽癌(Ⅲ、Ⅳ期)组织中LMP-1阳性表达率高于早期鼻咽癌(Ⅰ、Ⅱ期)，差异具有显著性［7］。因这些研究依据的分期标准不一，有的依据 1997 年 UICC 分期标准［8，11，12］，也有的依据1992年福州分期标准［7］，故LMP-1表达与鼻咽癌临床分期是否有关尚不能定论，我们对其病理类型进一步分析发现，非角化型癌的 LMP-1阳性表达率为90.10%，高于角化型癌82.14%，但是经过统计学处理后发现差异无显著性，与文献报道的相反［12］，有待于今后扩大样本量进一步确定。我们的研究结果还提示，LMP-1表达与不同临床T分期、年龄及性别无关，与文献报道的一致［7，8，11，12］。

本研究结果显示，鼻咽拭子LMP-1的表达与鼻咽癌颈部淋巴结转移呈正相关性，但未发现LMP-1与远处转移的相关性。LMP-1增强转移潜能的机制尚未完全明确，研究LMP-1与各种下游蛋白之间的信号转导路径，有助于进一步明确鼻咽癌的转移机制，对制定有效地抗肿瘤治疗措施具有重要的意义。此外，LMP-1还可以预测其放疗敏感性、复发率及远期生存率［7，22，23］。今后还需要进一步对入组患者进行密切的随访，同时扩大样本量进行研究，明确其对判断病变进展、预测放疗敏感性、评价肿瘤恶性程度及生物学行为的价值。

［1］ Hao SP，Tsang NM，Chang KP，et al.Screening nasopharyngeal carcinoma by detection of the latentmembrane protein 1(LMP-1)gene with nasopharyngeal swabs〔J〕.Cancer，2003，97(8):1909.

［2］ Wang D，Liebowitz D，Kieff E，et al.An EBV membrane protein expressed in immortalized lymphocytes transforms established rodent cells〔J〕.Cell，1985，43:831.

［3］ 刘 雄，李 刚，张 宝，等.重组腺相关病毒介导的特异性发夹状RNA敲低EB病毒潜伏膜蛋白1表达对鼻咽癌细胞转移的影响〔J〕.中华肿瘤杂志，2009，31(5):324.

［4］ Li X，Liu X，LiCY，etal.Recombinantadeno-associated virusmediated RNA interference inhibitsmetastasis of nasopharyngeal cancer cells in vivo and in vitro by suppression of Epstein-Barr virus encoded LMP-1〔J〕.Int J Oncol，2006，29(3):595.

［5］ 刘 雄，彭 英，李 刚，等.病毒潜伏膜蛋白对鼻咽癌细胞体外转移能力影响〔J〕.中国耳鼻咽喉头颈外科，2008，15(11):615.

［6］ 宋勇春，王 平.VEGF、LMP-1在鼻咽癌中的表达及其与预后的相关性〔J〕.天津医科大学学报，2007，13(4):556.

［7］ 姜武忠，赵素萍，廖遇平，等.鼻咽癌组织中 LMP1和VEGF蛋白表达及其临床意义〔J〕.中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2007，13(3):173.

［8］ 白薇琦，汤建国.鼻咽癌中环氧化酶-2和潜伏膜蛋白-1的表达和相互关系的初步研究〔J〕.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2009，23(3):105.

［9］ Tsuji A，Wakisaka N，Kondo S，et al.Induction of receptor for advanced glycation end products by EBV latent membrane protein 1 and its correlation with angiogenesis and cervical lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2008，14(17):5369.

［10］ 王 娟，徐洁洁，乔明哲，等.EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌组织中的表达及临床意义〔J〕.江苏医药，2009，35(5):508.

［11］ Horikawa T，Yoshizaki T，Sheen TS，et al.Association of latent membrane protein 1 and matrix metalloproteinase 9 with metastasis in nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cancer，2000，89(4):715.

［12］ Chen CL，Ou DL.Expression of syndecan-1(CD138)in nasopharyngeal carcinoma is correlated with advanced stage and poor prognosis〔J〕.Hum Pathol，2006，37(10):1279.

［13］ Horikawa T，Sheen TS，Takeshita H，et al.Induction of c-Met proto-oncogene by Epstein-Barr virus latentmembrane protein-1 and the correlation with cervical lymph node metastasis of nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Am J Pathol，2001，159(1):27.

［14］ Horikawa T，Yang J，Kondo S，et al.Twist and epithelialmesenchymal transition are induced by the EBV oncoprotein latentmembrane protein 1 and are associated withmetastatic nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cancer Res，2007，67(5):1970.

［15］ Ho CH，Chen CL，LiWY，et al.Decoy receptor3，upregulated by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1，enhances nasopharyngeal carcinoma cell migration and invasion〔J〕.Carcinogenesis，2009，30(8):1443.

［16］ Endo K，Kondo S，Shackleford J，et al.Phosphorylated ezrin is associated with EBV latentmembrane protein 1 in nasopharyngeal carcinoma and induces cellmigration〔J〕.Oncogene，2009，28(14):1725.

［17］ Tsai CN，Tsai CL，Tse KP，et al.The Epstein-Barr virus oncogene product，latent membrane protein 1，induces the downregulation of E-cadherin gene expression via activation of DNA methyltransferases〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:10084.

［18］ Wakisaka N，Kondo S，Yoshizaki T，etal.Epstein-Barr virus latentmembrane protein 1 induces synthesis of hypoxia-inducible factor 1 alpha〔J〕.Mol Cell Biol，2004，24(12):5223.

［19］ 谭运年，陶永光，李力力，等.EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌细胞中通过STAT3促进VEGF表达〔J〕.生物化学与生物物理进展，2004，31(5):427.

［20］ MillerWE，Earp HS，Raab-Traub N，et al.The Epstein-Barr virus latentmembrane protein 1 induces expression of the epidermal growth factor receptor〔J〕.J Virol，1995，69:4390.

［21］ Ren QX，Sato H，Murono S，et al.Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces interleukin-8 through the nuclear factor-ΚB signaling pathway in EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cell line〔J〕.Laryngoscope，2004，114(5):855.

［22］ Tsang N M，Chuang C C，Tseng C K，et al.Presence of the latent membrane protein 1 gene in nasopharyngeal swabs from patients with mucosal recurrent nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Cancer，2003，98(11):2385.

［23］ Hao SP，Tsang NM，Chang KP.Differentiation of recurrent nasopharyngeal carcinoma and skull base osteoradionecrosis by Epstein-Barr virus-derived latent membrane protein-1 gene〔J〕.Laryngoscope，2001，111(4 Pt1):650.