泛素-蛋白酶体通路与肿瘤发生的研究进展

张丹丹综述 张玉泉审校

泛素-蛋白酶体复合通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是Hershko等在20世纪末发现的1种高效蛋白质降解通路，该通路通过蛋白酶体选择性降解细胞内泛素化的蛋白质，不但能够破坏损伤陈旧的蛋白质，而且能够参与调节细胞的多种重要生命过程，精确降解细胞内各种目的靶蛋白，进而参与基因转录、细胞周期调节，以及受体胞吞、抗原呈递等各种细胞生理过程［1］。UPP的发现被认为是细胞周期、细胞恶性转化和免疫学研究的转折点。目前的研究显示，UPP与一系列女性生理过程和妇科疾病的发生有密切关系。

1 泛素的结构

泛素只存在并广泛存在于真核生物，是由76个氨基酸组成的多肽，相对分子量为8.45×103，是1种非常小的球形蛋白，常常通过与其他蛋白共价结合而发挥生物学作用。泛素属于热休克基因家属，具有高度保守性，在人与酵母之间也仅有3个氨基酸的差别。X线衍射分析泛素，包括4个β片层和1个α螺旋，共形成3个半转角，为1个紧密的球形结构。泛素基因有2种典型的存在状态:1种是Ub基因结合到核糖体蛋白基因上;另1种是以重复基因编码出线形的泛素分子链，即多聚泛素分子(polyubiquitinmolecule)。各个泛素单体之间可通过不同的氨基酸残基连接，并与底物蛋白连接成泛素多聚链，具有不同的功能。泛素单体间主要的连接残基为第48位的赖氨酸(Lys48)，而形成泛素多聚链的残基有Lys6、Lys11、Lys29、Lys63。通过不同的连接，泛素可以标记不同的蛋白底物，连接时都需要ATP水解提供能量。

2 泛素-蛋白酶体通路

泛素-蛋白酶体通路是生物体内进行蛋白质选择性降解的重要途径之一。主要包括泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素连接酶(ubi-quitin-conjugating enzyme，E2)、泛素蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligating enzyme，E3)、26S蛋白酶体及去泛素化酶(deubiquitinating enzyme，DUBs)等。动物细胞有2套蛋白酶体:①20S蛋白酶体，负责蛋白酶的激活并形成26S蛋白酶体的核心;②26S蛋白酶体，负责催化ATP依赖的泛素化蛋白的降解。

2.1 蛋白质泛素化降解途径

2.1.1 泛素的活化 泛素通过E1和E2被激活的过程称为泛素的活化。泛素的活化过程是1个依赖ATP的酶促反应(见图1):①首先由ATP提供能量，泛素C末端的甘氨酸(Gly)被泛素活化酶(ubiquitin activating enzyme E1)催化，形成Ub-腺苷酸中间产物，C末端被激活，然后激活的C末端被转移至E1酶内Cys残基的-SH键上，形成高能硫酯键;②通过转酰基作用，含有高能硫酯键的泛素进一步转移到泛素载体蛋白(ubiquitin conjugating enzyme，E2)特异的Cys残基上，形成E2-Ub巯基酯，E2-Ub巯基酯可使泛素C端甘氨酸与底物蛋白的Lys残基的氨基形成共价键;③在大多数情况下，底物蛋白先与泛素连接酶(ubiquitin ligating enzyme，E3)特异性结合，E3可使E2和底物蛋白相互接近，继而蛋白底物与E2酶连接的泛素结合，完成了底物蛋白质的泛素化。泛素也可以直接从E2转移给底物蛋白形成Ub蛋白复合物，这时的底物多为碱性蛋白 (如组蛋白)。泛素连接酶是泛素-蛋白酶体系统的重要成分，在癌形成过程中扮演着重要的角色［2］。

2.1.2 蛋白底物的降解 蛋白底物与泛素形成Ub蛋白复合物后，特异空间结构被展平，进入26蛋白酶体的催化中心降解。在26S蛋白酶体(proteasome)中(见图2)，中部20S蛋白酶体呈筒状外形，由内层2个β环和外层2个α环组成，α亚基主要用于底物识别，β亚基则负责底物降解。α亚单位环组组成20S蛋白酶体圆桶状结构的两端，环口中央被α亚单位N末端肽链占据，使α环的外侧完全关闭，其功能是阻止非目的靶蛋白质进入20S内被降解。近期有一项研究显示20S亚单位的组装是由哺乳动物细胞蛋白酶体生物合成的关键因子—蛋白酶体成熟蛋白(proteasomematuration protein，POMP)促进其在内质网内完成［3］。19S调节复合体可分为盖子(1id)和底座(base)2个次级复合物，底座位于20S蛋白酶体两侧，可加速底物泛素化及α环口开启，盖子是多聚泛素蛋白的受体。19S复合体主要起调节作用，特异性识别并结合泛素化的靶蛋白，改变靶蛋白构象。泛素化蛋白被识别后转移至核心蛋白被降解［4］，而负责“标记”靶蛋白的泛素被解离下来，释放到胞质中循环重复使用［5］。

2.1.3 泛素的再循环 泛素属于长寿命蛋白，在泛素系统中存在能够特异切割泛素链的C末端的泛素解离酶(DUBs)。在泛素蛋白偶连物水解之前，泛素解离酶将泛素从底物上解离下来。DUBs属于蛋白酶超家族，根据其催化机制，可以分为5类(天门冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)。DUBs能够特异性识别泛素C末端与相连的最后1个残基(Gly76)分子之间形成的共价键，使其断开。DUBs促进泛素分子再循环，是泛素系统的正常运行的必要成分。

图1 泛素的活化过程

图2 Ub蛋白复合物的降解

2.2 泛素-蛋白酶体途径与肿瘤的关系

泛素-蛋白酶体途径是细胞内ATP依赖的蛋白质选择性降解的主要途径，是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与细胞凋亡、MHCⅠ类抗原的递呈、细胞周期以及细胞内信号转导等多种生理过程，对维持细胞的稳态具有十分重要的意义［6］。有研究认为蛋白质的泛肽化与包括细胞凋亡在内的许多细胞活动过程有关［7，8］。UPP通过26S蛋白酶体降解一些与凋亡相关的蛋白，如转录因子，凋亡前蛋白和抗凋亡蛋白等，发挥调控细胞凋亡的作用。

2.2.1 UPP对转录因子NF-κB的调控 核因子kappa增强子结合蛋白 (nuclear factor kappa enhancer binding protein，NF-κB)是细胞中重要的转录因子，控制着细胞的免疫应答、炎性反应和凋亡等过程。泛素化调控着NF-κB活化过程当中的许多步骤:NF-κB的抑制子核因子kappaB抑制子(inhi-bitor of nuclear factor，kappa2B，IκB)的降解，IκB 激酶(IκB kinases，IKK)的活化等［9］。正常情况下细胞转录因子蛋白NF-κB活性被I-κB抑制，在诱导 NF-κB 的应激刺激下，激活 IκB 激酶(IKK)。NF-κB活化过程中，E3酶上的环指模TRAF6首先被细胞膜上的TNF受体和IL-1受体及其配体激活，然后与E2酶上的1个复合体泛素变构酶1A(ubiqitin emzyme 1A，UBC132UEV1A)共同作用，被K63泛素链修饰，K63泛素链可被特定的激酶受体蛋白的锌指模序所识别［10］。泛素化的TRAF6募集相关的蛋白，以K63链为骨架进行装配信号复合体，催化IKK的上游激酶TAK1〔转换生长因子(transforming growth factor，TGFβ)激活激酶(TGFβ-activated kinase)〕磷酸化，进而激活 IKK，引起 IκBα磷酸化和泛素化，IκB的空间构象发生变化，从而被ATP依赖性26S的蛋白酶体所识别并降解，这一过程可被蛋白酶体抑制剂所阻断［11］。IκB 的降解解除了对 NF-κB 的抑制作用，NF-κB被释放至细胞核，激活抗凋亡基因如bcl-2等，发挥其抗凋亡作用，最终导致恶性肿瘤的发生。研究还发现肿瘤细胞中降解I-κB的蛋白酶体活性增加，细胞内NF-κB水平升高。

2.2.2 UPP对p53蛋白的调控 抑癌基因p53的表达产物可以通过激活靶基因实现凋亡调控功能，是细胞内重要的凋亡调控因子。E3RNG家族成员癌基因调节蛋白鼠双微粒体(murine dou-bleminute 2，MDM2)作为1种癌基因蛋白具有负反馈调节p53的作用。MDM2含有环指样结构域，具有泛素连接酶E3的作用，可以促进p53产物从核内向细胞质转运，使之被泛素化后被26S蛋白酶体降解［12］而失去活性，MDM2具有抗凋亡作用。MDM2已经发现在多种肿瘤中表达明显升高，是导致野生型p53在恶性肿瘤中表达降低的1个重要原因。Stedk等［13］在研究视网膜母细胞瘤时发现，在高表达MDM2的视网膜母细胞瘤细胞中，进入S期的肿瘤细胞明显增多，凋亡细胞比例下降;敲除MDM2基因后，肿瘤细胞凋亡比例上升。在以往研究人乳头瘤病毒(HPV)感染相关的人宫颈癌细胞时发现，高危组HPV引起的宫颈癌中，p53蛋白表达水平明显降低，p53的功能被抑制。这是由于16或18型HPV编码的癌蛋白E6可促进E3家族成员泛素蛋白连接酶E6-AP(E6-associated protein)和p53蛋白结合高，使p53蛋白被UPP过度降解［14］;而低危组的E6与p53蛋白则结合低，很少发生过度降解，故高危组HPV更易导致宫颈癌。Kelley等［15］研究证明E6蛋白几乎所有与转录有关的功能均受到E6AP的调节。Borbely等［16］发现HPV16表达的E6蛋白可以通过对p53的泛素化降解，从而激活凋亡抑制基因survivin启动子并诱导其转录。

2.2.3 UPP 与 Skp2 Skp2(S-期相关蛋白 2 S-phase kinase associated protein2)是F-box蛋白家族中成员之一。Skp2基因位于人染色体5p13，分子量约45 kd，能与s期激酶cyclinH-CDK2相互作用。Skp2作为SCF复合体(Skp1-Cullin-F-Box蛋白复合体)的底物识别亚基，能够特异性识别底物并介导其泛素化降解。目前已证明，通过Skp2依赖性泛素-蛋白酶途径可以降解许多细胞周期调控蛋白，如p27，p21，Cyclin D1和Cyclin E等等。p27是1种细胞周期蛋白抑制因子，能够阻滞细胞周期的进展从而抑制细胞的增殖，是1个重要的细胞周期负性调控因子。Skp2能特异性识别p27，介导其泛素化降解，与肿瘤的形成关系密切。最近研究显示，在p27缺失时，CyclinE-Cdk2可增加Skp2的磷酸化，这种磷酸化增加Skp2的自动泛素化，而p27可以抑制Skp2的磷酸化和自动泛素化［17，18］。已有大量的研究表明，在恶性实体肿瘤中p27常呈低表达，Skp2则常呈高表达，且两者关系呈负相关。Sui等［19］用免疫组化法检测卵巢肿瘤(33例良性和47例恶性)时发现，在卵巢的恶性肿瘤中Skp2的阳性表达率较良性肿瘤有所增加，且无论是在良性还是恶性卵巢肿瘤中，Skp2和p27之间都呈负相关。

2.2.4 UPP与抑癌基因VHL VHL基因产物pVHL是E3水解酶的组成成分之一，介导缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)泛素化降解，可抑制肿瘤间质血管的生成。VHL基因突变后，造成HIF表达水平上升，HIF诱导上皮细胞不断增殖，并利于肿瘤的侵袭转移。有实验证明，由于在VHL基因缺陷引起肾细胞癌的裸鼠模型中，被导入VHL后，肿瘤生长受到抑制。Kim等［20］发现转染了含VHL cDNA的腺病毒的肾透明细胞癌细胞株，可被诱导了凋亡，提示VHL与诱导肿瘤细胞的凋亡有关。

3 蛋白酶体抑制剂PS-341

针对泛素-蛋白酶体在肿瘤发生中的作用机制，国内外已对蛋白酶体抑制剂展开研究。根据蛋白酶体抑制剂与蛋白酶体的活性位点的苏氨酸残基反应的药效基团，目前可将其分为5类:醛基肽类、硼酸肽类、乙烯磺基肽类、环氧酮类和β-内酯类。醛肽类是第一类被发现和广泛应用的蛋白酶体抑制剂，但醛肽类化合物选择性和稳定性较差，易被氧化。硼酸肽类比醛肽类具有更强的蛋白酶体抑制作用，更具选择性，是比较理想的蛋白酶体抑制剂。其中，硼替佐米(Bortezomib，PS-341)选择性高，副作用小，是首个被用于临床的蛋白酶体抑制剂。该药物已被证明可以通过特异性地抑制细胞内26S上糜蛋白酶活性，干扰细胞信号转导通路，最终诱导肿瘤细胞凋亡［21］。美国FDA已批准该药用于治疗复发性、难治性多发性骨髓瘤。

在临床前研究中发现，细胞培养中的PS-341可以诱导血液系统和实体瘤的恶性肿瘤的凋亡。PS-341通过调节前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的稳定性，以及抑制NF-κB的活化，诱导细胞凋亡。另有实验证明PS-341抑制蛋白酶体干扰了未折叠蛋白质应答，引起内质网应激和增加凋亡。目前认为蛋白酶体抑制剂是1种潜在的抗癌与抗炎药，通过抑制NF-κB活化可以减少细胞素、酶、细胞黏附分子的表达，从而发挥抗炎作用。在对多发性骨髓瘤、胰腺癌的小鼠模型以及前列腺癌裸鼠移植瘤模型的研究中发现，Bortezomib能明显抑制肿瘤生长，提高生存率，减少肿瘤新生血管形成［22］。O’Connor等在PS-341的Ⅱ期临床试验中，给予淋巴瘤患者PS-341 1.5 mg/m2，结果显示患者对PS-341有很好的耐受，PS-341对淋巴瘤患者有显著的单剂效应，整体的反应率为58%［23］。

有文献报道，胞苷脱氨基酶是1种具有抗HIV病毒的酶，而HIV的病毒感染因子加速该酶被UPP通路降解。蛋白酶体抑制剂可以阻断UPP通路，从而保护胞苷脱氨基酶发挥抗癌作用。在PS-341的临床Ⅰ期与Ⅱ期实验中显示了卓有成效的抗肿瘤作用和可控制的毒性作用。

随着人们对肿瘤发生的分子机制逐渐深入的研究，越来越意识到泛素介导的蛋白质降解途径在肿瘤发生中的重要性，逐渐把它作为肿瘤治疗的主要靶点之一。许多研究表明，很多抑制蛋白酶体活性的药物可以促进肿瘤细胞凋亡，杀死细胞，克服抗药性，增强肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。相信随着研究的深入，越来越多的蛋白酶体抑制剂将会用于肿瘤的治疗中。

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