麻鸡脾脏总RNA提取方法初探

陈书明，常云花，梁新峰，曹新鹏，范 瑾

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

白细胞介素（Interleukin，IL）简称白介素，是由白细胞产生并介导于细胞间相互作用的一类细胞因子。其主要作用是通过T和B淋巴细胞及NK细胞等多种靶细胞来传递免疫信息，以激活、调控血细胞的生长发育与分化成熟，并参与机体的免疫应答以及某些疾病的病理过程[1-3]。目前，IL已作为药物应用于临床，但用传统的从组织中分离纯化IL，很难实现IL的大量生产。因此，通过RT-PCR技术获得IL的目的基因，再用基因工程技术规模化生产IL成为科研工作者努力的方向。而获得IL的目的基因需要先从脾脏组织提取出纯度高、完整性好的总RNA。目前，已有多种方法与产品应用于总RNA提取和纯化，但在实验过程中，总RNA极易被实验室环境中存在的RNA酶降解，或提取出来的总RNA中常伴有大分子量染色体DNA的污染[4-7]。

本研究通过控制RNAiso Plus试剂和脾脏组织用量比例，对组织和实验室环境进行特殊处理，反复研究，最终从麻鸡脾脏组织中提取出纯度高、完整性好的总RNA。该研究对分子克隆获得相关目的基因等后续实验具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 自山西省太谷县某鸡场购进80日龄健康麻鸡1只。

1.1.2 试验试剂 Agarose（琼脂糖）为Amresco原装进口；RNAiso Plus购自大连宝生物工程有限公司；Tris和DEPC均购自上海生物工程技术服务有限公司；EDTA、硼酸、95%乙醇、异丙醇、氯仿、溴化乙锭均为国产分析纯。75%乙醇、溴化乙锭等用RNase-free ddH2O配制。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备 在洁净环境下将麻鸡杀死，迅速取出其脾脏，用刀片切成约140，120，80mg的小块组织，用灭菌纱布包裹后悬吊于液氮罐中保存备用。提取RNA时，从液氮罐中取约140，120，80mg小块组织各1块，迅速转移至3个液氮预冷的研钵中研磨，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，否则会影响RNA的收率和质量）；再向3个研钵中各加1mL RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温下静置，待其溶化；然后将各组匀浆液转移至已标记的EP管中，室温静置5min。

1.2.2 制备RNA沉淀 将EP管中的匀浆液在4℃，12 000 r/min条件下离心5min；小心吸取上清液，分别移入已灭菌标记的EP管中（切勿吸取沉淀）；再向EP管中分别加入0.2mL氯仿，盖紧管盖，用旋涡振荡仪混匀至溶液呈乳白状（无分层现象），室温静置 5min；4℃，12 000 r/min离心15min。此时，EP管中液体分为3层，即含有RNA的无色上清液，中间的白色蛋白层和带有红色的下层有机相。小心吸取上清液并分别转移至新标记的3个已灭菌的EP管中（切勿吸取白色中间层），再分别加入等体积的异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀，室温下静置10min；然后于4℃，12 000 r/min离心10min，可见EP管底部出现乳胶状沉淀，小心弃去上清液，保留沉淀，即为RNA沉淀。

1.2.3 RNA沉淀的洗涤 沿保留RNA沉淀的EP管的管壁缓缓加入75%的乙醇1mL，轻轻上下颠倒EP管5次，在4℃下，12 000 r/min离心5min；然后小心弃净EP管中的乙醇溶液，再将EP管插入超净工作台面的样品孔中，通风干燥5min，使乙醇挥发干净（不可以加热干燥，否则RNA将很难溶解），再用RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀，从而获得RNA溶液。

1.2.4 RNA纯度与完整性的检测 取3μL RNA溶液与等量的上样缓冲液混匀，点样，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测所提取RNA的纯度与完整性。用紫外分光光度计测定剩余RNA溶液的A260与A280，并计算二者的比值A260/A280，进一步分析所提取RNA的纯度。

2 结果与分析

对脾脏组织用量约为80 mg时提取的总RNA进行紫外分光光度检测得出，A260=0.896，A280=0.452，A260/A280=1.982。

从图1可以看出，当组织用量约140mg时，RNA几乎全部降解（图1-A）；当组织用量约120mg时，RNA降解严重（图1-B）；当组织用量控制在约80mg左右时，提取到的RNA电泳图谱中可见清晰的3条带（图1-C），分别为5S，18S，28 S，A260/A280=1.982，1.8＜A260/A280＜2.0，说明从鸡脾脏组织中提取的RNA纯度与完整性良好。表明用1mL的RNAiso Plus试剂，并且把脾脏组织用量控制在80mg左右时，可提取出纯度高、完整性好的总RNA。

3 讨论

本研究表明，用相同量的提取剂（RNAiso Plus）提取麻鸡脾脏组织中的RNA时，并不是组织越多，提取的RNA量就越多；相反，过量的组织中存在过量的RNA酶，所加的RNAiso Plus试剂不能抑制过量RNA酶的活性，使得提取过程中RNA很快被降解。但是，试验所用脾脏组织也不可太少，否则会因样品中总RNA含量不足，难以提取出足够量的纯度高、完整性好的总RNA。

本实验成功与否的关键是有无RNA酶的污染。RNA极不稳定，易被RNA酶降解，而RNA酶几乎无处不在，且特别稳定，故在提取RNA时需最大程度地避免外源RNA酶的污染和抑制内源RNA酶的活力。因此，在本实验中，除了用液氮迅速处理新鲜的麻鸡脾脏组织、控制RNAiso Plus试剂和脾脏组织用量比例，以抑制内源RNA酶的活力外，还用DEPC溶液对本实验所用物品进行了处理，使用RNA专用仪器设备，操作过程中使用一次性PE手套和口罩等。上述措施对本实验的成功起了非常重要的作用。

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［4］ 李晶，王亦学，郑德刚，等.一种简单高效提取棉花不同组织总 RNA的方法[J].山西农业科学，2009，37（5）:17-19.

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