亚比棉×陆地棉杂种F1遗传分析

渠云芳，黄晋玲，贺润平

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院植物保护研究所，山西太原030032）

棉花有51 个种[1]，除了4 个栽培种之外，其余的为野生种。野生种具有很多栽培种不具有的优良特性，尤其是在抗逆性、抗病虫、种子无腺体植株有腺体等方面[2]。为了将野生种的优良特性转移到栽培种上，提高栽培种尤其是栽培陆地棉的应用价值，国内外育种专家早已广泛开展了棉属远缘杂交野生棉特性的转育工作，已经获得了20 余种野生资源与陆地棉的高代杂种，并从中选育了大批性状基本稳定的陆地棉型优异种质系[3-6]。山西农业大学棉花育种组为了将比克氏棉的子叶腺体延缓形成特性转移到陆地棉上，采用先把亚洲棉（G arboreum）和比克氏棉（G bickii）杂交，然后再进行染色体加倍，将合成的异源四倍体再与陆地棉（G hirsutum）杂交，获得了三种杂种。本研究从细胞学以及RAPD 分子标记技术方面，对亚比棉与陆地棉合成的三种杂种进行了遗传分析，并检测了三种杂种中野生棉与栽培棉的遗传成分，为以后的研究奠定一定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料：1.亚洲棉（A2）；2.比克氏棉（G1）；3.亚洲棉×比克氏棉异源二倍体（A2G1）；4. 亚洲棉×比克氏棉双二倍体（A2A2G1G1）；5. 陆地棉（[AADD]1）；6.（A2×G1）×（[AADD]1）。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞学方法 种子预先浸种1 d，于25～30 ℃条件下发芽，待根尖长至2～3 cm 长时，截取2～3 mm的根尖，用饱和对二氯苯溶液预处理2.0～2.5 h，卡诺固定液（无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1）固定2～24 h，2%纤维素酶和果胶酶混合水溶液在28～35 ℃下酶解30～60 min，经预热60 ℃的0.5 mol/LHCl 解离8～15 min，卡宝品红染色压片。

核型分析方法参照聂如芝[7]的报道，将所得染色体图像进行编号，并测量其长臂、短臂值，根据所得数据进行同源染色体的人工配对，并按染色体的长度从长至短顺序编号，最后取5～12 个细胞染色体参数平均值作为该棉种的染色体数。

1.2.2 RAPD 分子标记方法

1.2.2.1 总DNA 的提取 参照CTAB 法[8]进行。

1.2.2.2 引物及其来源 使用的15 个随机引物（长度为10 个核苷酸序列），均购于上海生物技术公司。

1.2.2.3 RAPD 反应 在PTC-100 热循环仪上进行。反应体积为25 μL，其中含1×buffer，1.5 mmol/LMgCl2，0.2 mmol/LdNTP，0.4 μmol/L引物，50 ng DNA，1.0 U Taq 酶，双蒸水补足25 μL，上覆30 μL矿物油。

PCR 反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，36 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，共10个循环；89 ℃变性20 s，36 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，共35 个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保温10 min。扩增产物经1%琼脂糖电泳，胶中加入0.5 g/LEB。电泳结束后，紫外检测，凝胶成像分析系统扫描照相。

每次试验均重复2 次，只有2 次重复均相同的扩增带才被用作特征带分析。

1.2.2.4 数据统计分析 RAPD 扩增产物以0，1统计建立数据矩阵，在相同迁移位置上有带的记为1，无带的记为0。

2 结果与分析

2.1 亚比棉×陆地棉杂种F1 的核型分析

从图1 可以看出，三种杂种亚比棉×陆地棉的染色体数目为2n=4x=52。参照Levan[9]的方法按着丝点位置划分染色体类型，其核型公式为：2n=4x=52=2M+44m（2SAT）+6sm（2SAT）。

表1为三种杂种亚比棉×陆地棉的染色体参数。从表1 可以看出，其染色体相对长度的变异范围在6.12%～2.56%之间。臂比值变化于1.00～1.82 之间，最长染色体与最短染色体之比为2.39∶1，平均臂比为1.35，臂比大于2∶1 的染色体百分率为0。根据Stebbins[10]的核型分类标准，核型类型为1B。其中，第7，8，9，10 对为亚中着丝粒（sm）染色体，第18 对为正中着丝粒（M）染色体，余者均为中着丝粒（m）染色体。在第10，13 对染色体短臂上各带有1 对随体。

表1 亚比棉×陆地棉杂种F1 的染色体参数

2.2 RAPD 分析

2.2.1 引物筛选与RAPD 标记的多态性 根据有关棉花的相关文献，从初选的引物中筛选出15 个能扩增出多态性带的引物。从表2 可以看出，15 个引物均有扩增产物，总共扩增出115 条DNA 带，其中多态性带为95 条，多态性比例占82.6%。引物不同扩增的片段数也不同，平均每个引物可扩增出7.7 条DNA 带。从表2 还可以看出，不同引物扩增出的DNA 带差异极大，最多的可扩出15 条带（S37），最少的仅有3 条带（S1485和S1288），而且多态性也不同，多态性带所占比例变化幅度也大。多态性位点百分率最高的为100%，最低的为33.3%。这是因为三种杂种分别属于3 个不同的染色体组的野生种与栽培种，其亲缘关系比较远，所以参试材料表现出丰富的多样性。

表2 不同随机引物扩增6个材料的多态性

2.2.2 亚比棉×陆地棉杂种F1及其亲本的多态性差异比较 亚洲棉、比克氏棉、陆地棉、亚比棉与亚比棉×陆地棉F1杂种的多态性差异比较如图2 所示。

从15 个引物对三种杂种及其各个亲本的扩增结果看，亚比棉×陆地棉杂种F1共扩增出61条DNA 带，其中具亚洲棉特异带的为2 条，占总带数的3.3%；来自比克氏棉的带为6 条，占9.8%；具陆地棉特异带的为8 条，占13.1%；来自亚比棉的特异带为6 条，占9.8%。在杂种后代中还有一些其他带型，如与亚洲棉和比克氏棉相同的带6 条，与比克氏棉和陆地棉相同的带7 条，与亚洲棉和陆地棉相同的带3 条。杂种的特异带为9 条，占14.8%。材料中还检测到双亲的共有带，表明后代中存在着丰富的遗传变异。以上结果也表明，利用RAPD 技术可以检测远缘杂种材料中亲本的遗传成分。

3 讨论

3.1 染色体的探讨

三种杂种亚比棉×陆地棉的染色体数目为52 条，与亲本陆地棉、亚比棉的染色体数目相同，但染色体类型变化很大，有44 条中着丝粒染色体（m），6 条亚中着丝粒染色体（sm），还有2 条正中部着丝粒染色体（M）。这与亲本的染色体形成了极大区别。亚比棉双二倍体有50 条中部着丝粒染色体（m），亚中着丝粒染色体（sm）有2条。陆地棉有32 条中部着丝粒染色体（m），有18条亚中着丝粒染色体（sm），有2 条近端着丝粒染色体（st）。根据所得的染色体参数，可初步判定杂种的第2 对染色体可能来自亚洲棉的第13对，杂种的第6，11，19 对染色体可能来自亚比棉的第2，5，18 对，亚比棉×陆地棉的第4，7，8，17，21，24 对染色体可能来自陆地棉的第3，6，9，14，18，25 对。

3.2 利用RAPD 可以检测远缘杂种后代各个亲本的遗传组成

刘根齐等[11-12]和聂以春等[13-14]分别利用RAPD 分子标记技术，对少数种间杂交系进行了分析，结果均表明，种间杂交种质系中均发现野生亲本的特征带，认为利用RAPD 标记技术可以检测到种间杂交系中的野生亲本遗传成分。李景环等[15]用RAPD 标记对加拿大披碱草和老芒麦及其杂种F1，F2进行了研究，研究结果充分验证了杂种的真实性。云兴福等[16]利用RAPD 标记对黄瓜自交系及其F1代进行了研究，揭示了黄瓜亲本自交系及其与F1的遗传差异，研究结果表明，RAPD 标记用于黄瓜遗传差异的研究切实可行。本研究利用RAPD 技术，在杂种F1中既检测出了与亚比棉相同的带，又检测出了与陆地棉相同的带，还分别检测出了与比克氏棉、亚洲棉相同的带，并且还检测出了杂种的特异带，这说明利用RAPD 分子标记可以检测种间杂交系中的野生棉遗传成分，可以促进种间杂交在常规育种、理论研究等领域的有效利用。

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