菠萝皮发酵生产饲料蛋白优良菌种的筛选

广东海洋大学食品科技学院 黄 和 王 玲 陈仰真

菠萝是我国南方栽培面积较大，产量较多的典型热带水果之一。据统计，我国每年菠萝产量约200万吨。由于新鲜菠萝果实不易贮存，除少部分直接鲜销外，大部分被加工成罐头、果汁、果酱、果酒等产品。在这些菠萝产品的加工过程中，占全果重的50%～60%的菠萝果实加工副产物——果皮渣通常被加工厂直接丢弃，既浪费了资源，又造成一定程度的环境污染。资料表明，菠萝皮渣中的水分、总酸和总糖等含量与果肉相差无几，粗蛋白质和灰分的含量还高于果肉，分别是后者的2.5倍和 3.0 倍（Sanchaisurinya 和 Thammabut，1994）；另外，菠萝皮中还富含适合微生物生长的纤维素等碳源物质。

本研究以菠萝皮为原料，烘干粉碎后按一定比例加入麸皮等辅料，分别接种单一霉菌、酵母菌以及霉菌与酵母菌混合菌种发酵生产高产蛋白饲料，对各发酵条件下所得的产品的蛋白质含量、感官指标等进行了考核，以期获得理想的高产蛋白菠萝皮渣发酵菌种，为菠萝皮渣高效发酵生产饲料蛋白提供有力保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料 菠萝皮渣：取自广东湛江鹰峰食品有限公司菠萝罐头加工车间。取回后于80℃烘干粉碎备用，研究时按以下配方做成培养基：菠萝皮渣（干粉）74%，麸皮 20%，（NH）2SO43%，尿素 2%，KH2PO41%，料水比为 1∶1，自然 pH 值。

菌种：白地霉、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、扣蘘拟内孢霉、黑曲霉、绿色木霉2、绿色木霉1，对应的代号为 1、3、4、5、6、7、8， 购自广东省微生物所；菠萝皮发酵筛选酵母、菠萝皮发酵筛选霉菌1、菠萝皮发酵筛选霉菌 2，对应的代号为 2，9，10，是由本实验室筛选得到的，未经过鉴定。

1.2 主要药品及试剂 尿素、（NH）2SO4、KH2PO4、硫酸钾、硫酸铜、硼酸、氢氧化钠均为分析纯。

1.3 主要仪器和设备 鼓风干燥箱、组织粉碎机、恒温培养箱、生化培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、分光光度计等。

1.4 分析检验方法 水分含量的测定：常压干燥法（GB/T 5009.3-2003）；灰分的测定：灰化法（GB/T 5009.4-2003）；粗脂肪的测定：索式抽提法（GB/T 5009.6-2003）；粗纤维的测定：酸碱洗涤法（GB/T 5009.10-2003）； 还原糖的测定：3，5-二硝基水杨酸法，大连轻工业学院（1994）；纤维素酶酶活的测定方法：分光光度法（NY/T 912-2004）；原料粗蛋白质的测定：饲料中粗蛋白质测定方法（GB/T 6432-1994）；发酵产物粗蛋白质含量的测定：饲料中粗蛋白质测定方法（GB/T 6432-1994）；发酵产物水洗含氮化合物后粗蛋白质（简称水洗蛋白）含量的测定：饲料酵母中水洗蛋白测定方法（QB/T 1940-1994）。

1.5 研究方法

1.5.1 单一菌种筛选试验 按1.1中的配方配制培养基（以下同），以5%的接种量分别接入单一霉菌和酵母菌的扩大培养液，在28℃下霉菌培养108 h，酵母菌培养72 h，培养物在80℃烘干后分别测定粗蛋白质含量、水洗蛋白含量，预选出蛋白质含量较高的酵母和霉菌。

1.5.2 混合菌种筛选试验 将1.5.1方法选出的酵母和霉菌分别以不同的组合按1∶1的比例、5%的总接种量接入培养基中，进行双菌种混合发酵，28℃培养108 h后，测定蛋白质含量并进行感官评价，选出产物蛋白质含量高的组合为最优组合。

1.5.3 混合菌种的接种比例和接种量的确定 将混合菌种发酵所选出的产物蛋白质含量最高的组合分别按不同的接种比例、不同的接种量进行混合菌种发酵试验，28℃培养108 h后，测定蛋白质含量并进行感官评价，最终确定理想的发酵菌种的接种比例和接种量。

2 结果与分析

2.1 单一菌种筛选试验 用10株不同的霉菌和酵母菌株进行单一菌种发酵试验，测定各发酵产物的粗蛋白质含量及水洗蛋白含量，结果见表1。

由表1可知：发酵产物的粗蛋白质含量高的，水洗蛋白含量不一定高，这是因为各种微生物对含氮化合物的利用情况各不相同。在选取优良菌种时，应选择对含氮化合物利用较好的菌种。对于发酵后的菠萝皮饲料蛋白，应以水洗去除含氮化合物后测得的粗蛋白质含量比直接测得的粗蛋白质含量作为标准比较合理。因为水洗去铵态氮等含氮化合物后再检测蛋白质，虽会同时洗去部分氨基酸和水溶性蛋白，但所得结果能较客观地反映出发酵产物中的粗蛋白质含量，有效地避免培养基中微生物未利用的含氮化合物对蛋白质测定的影响。对表1中的单一菌种发酵后的产物蛋白质含量进行比较，发酵产物水洗后蛋白质含量较高的5株菌种依次为：黑曲霉，绿色木霉2，白地霉，菠萝皮筛选酵母，产朊假丝酵母。由于菠萝皮筛选酵母发酵所得的产物中的蛋白质含量无明显优势，菌种还未经鉴定，所以该菌种暂时不予以采用，而选用其他四种菌作为混菌发酵的出发菌种。

表1 单一菌种发酵后产物的蛋白质含量 %

2.2 霉菌纤维素酶活力的测定 菠萝皮含有相当数量的纤维素，霉菌能分泌纤维素酶来分解纤维素使之转化为各种糖类物质，供给酵母合成蛋白质等营养物质。所以测定霉菌纤维素酶活力能够更好地确定菌种分解纤维素的能力。为此，对本研究所采用的6株霉菌按照NY/T 912-2004和刘德海（2002）的方法进行羧甲基纤维素酶活力的测定，以保证所选的霉菌具有强的纤维素分解能力。纤维素酶活力测定的标准曲线见图1，6株霉菌纤维素酶活力的测定见表2。

由表2可知，6株霉菌中绿色木霉2和黑曲霉比其他菌有非常明显的羧甲基纤维素酶活力，这与表1的结果是相吻合的。也就是纤维素酶活力强的霉菌，其发酵后产物的蛋白质含量也高。

2.3 混合菌种筛选试验 将单菌发酵试验中选出的4株发酵产物蛋白质含量较高的菌株，即绿色木霉2、黑曲霉、白地霉、产朊假丝酵母经过不同双菌种组合按1∶1的比例进行混合发酵试验，其组合方式和发酵结果见表3。

图1 纤维素酶活力测定标准曲线

表2 纤维素酶活力

从表3可看出，霉菌与酵母菌组合双菌发酵产物的水洗蛋白含量明显高于对照组的单菌发酵，这个结果也与郭维烈等（2002）报道的霉菌与酵母菌组合发酵可以提高菌体蛋白饲料的生产效率相吻合。其中，产朊假丝酵母和绿色木霉这个组合的发酵产物蛋白质含量比较高。可以初步认为是理想的发酵菌种组合。

表3 混合菌种组合方式和发酵产物蛋白质含量 %

为进一步判断各种菌种不同组合的发酵效果，通过观察各菌种在发酵培养基上的生长情况来考察发酵产物的外观，结果见表4。

在培养24 h后，白地霉+绿色木霉2和产朊假丝酵母+黑曲霉组合有白色少量菌丝，白地霉+绿色木霉2和产朊假丝酵母+绿色木霉2组合则没有变化，48 h后白地霉+黑曲霉和产朊假丝酵母+黑曲霉布满白色菌丝，白地霉+绿色木霉2和产朊假丝酵母+绿色木霉2也有部分白色菌丝出现，在培养108 h之后，产朊假丝酵母+绿色木霉2组合培养基布满了白绿色菌体且色泽均匀，白地霉+绿色木霉2组合培养基也分布了少量白色菌体但色泽不均匀，白地霉+黑曲霉和产朊假丝酵母+黑曲霉组合培养基因被黑色菌体覆盖而略呈黑色。

表4 混合菌种在发酵培养基上的生长情况

烘干粉碎后产朊假丝酵母+绿色木霉2组合的发酵产物有气味芳香，白地霉+绿色木霉2还有原菠萝皮味，白地霉+黑曲霉和产朊假丝酵母+黑曲霉组合虽气味芳香但呛鼻且颜色太黑。

综合前面所述的发酵产物的蛋白质含量和各菌种在发酵培养基上的生长情况及烘干粉碎后的感官评价，可以认为产朊假丝酵母+绿色木霉2是最佳菌种组合。

2.4 最佳菌种组合接种比例的确定 为研究最佳菌种组合的使用比例，用上述试验所选出的菌种组合，将产朊假丝酵母和绿色木霉2分别按1∶5（0.2）、1∶2（0.5）、1∶1（1.0）、3∶2（1.5）、2∶1（2.0）、3∶1（3.0）、5∶1（5.0）、7∶1（7.0）的接种比例以5%的接种量接种后进行发酵试验，测定发酵产物的蛋白质含量，结果见图2。

图2 不同接种比例对产物蛋白含量的影响

由图2可以看出，在产朊假丝酵母∶绿色木霉2接种比例小于 3∶2（1.5）时，粗蛋白质和水洗蛋白的含量随着两者比例的增大而升高，但当两者接种比例大于1.5即大于3∶2后，粗蛋白质和水洗蛋白的含量逐渐下降，由此可以认为：产朊假丝酵母对发酵产物中蛋白质含量的影响较绿色木霉的影响大。原因是酵母利用了发酵原料中较多的糖分和无机盐后在短时间内合成了蛋白质。但在发酵过程中，木霉的作用也是必不可少的，因为它可分泌大量的纤维素酶，使菠萝皮中的纤维素分解后转化成糖类物质，为酵母的生长繁殖提供必要的碳源和能量，并为蛋白质的合成提供充足的物质基础；从感官状态看，在不同菌种比例的发酵产物中，产朊假丝酵母∶绿色木霉2的接种比例为3∶2时发酵产物具有浓郁的香味，色泽淡黄。但当绿色木霉2接种比例增大时，发酵产物有明显的霉味，色泽会变绿。因此，产朊假丝酵母∶绿色木霉以3∶2的比例进行组合，发酵产物的蛋白质含量及感官评价最好。

2.5 混合菌种最佳接种量的确定 将产朊假丝酵母C+绿色木霉L以3∶2的比例分别按2%、5%、10%、15%、20%的总接种量接入发酵培养基，进行发酵实验，其蛋白质含量见图3。

图3 不同接种量对发酵产物蛋白含量的影响

由图3可知，在接种量小于5%时，随着接种量的增多，粗蛋白质和水洗蛋白含量逐渐增加，当接种量超过5%以后，两种蛋白质含量都不再增加，曲线在平缓中略有下降。所以，最佳接种量为5%。

2.6 菠萝皮发酵前后的蛋白含量及感官评价见表5。

从表5可看出，经过产朊假丝酵母和绿色木霉2混合发酵后的菠萝皮发酵产物，粗蛋白含量提高了，为24.71%，水洗粗蛋白含量也达到了16.96%，产品具有浓郁的酵母甜香味。根据国家标准（QB/T 1940-1994），动物饲料蛋白要求粗蛋白质含量大于20%，因此，本研究所得的菠萝皮发酵产物适于做动物蛋白饲料。

表5 菠萝皮发酵前后的蛋白质含量及感官评价

3 结论

以菠萝皮为原料，经烘干粉碎后添加麸皮20%、（NH）2SO43%、尿素 2%，KH2PO41%作为培养基发酵生产饲料蛋白，产朊假丝酵母和绿色木霉是理想的发酵菌种，将两者以3∶2的比例、总接种量为5%等条件进行发酵后，菠萝皮干粉中的粗蛋白质含量从原来的4.98%提高到24.71%，水洗去含氮物质后粗蛋白质含量提高到16.96%。达到了国家动物饲料蛋白含量的要求。菠萝皮发酵后所得的饲料产品气味芳香，适口性好。

[1]GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法[M].北京：中国标准出版社，1994.

[2]NY/T912-2004.饲料添加剂.纤维素酶活力的测定[M].北京：中国标准出版社，2004.

[3]QB/T1940-1994.饲料酵母[M].北京：中国标准出版社，1994.

[4]大连轻工业学院，华南理工大学.食品分析[M].北京：中国轻工业出版社，1994.

[5]郭维烈，郭庆华，谢小宝，等.4320菌体蛋白饲料中双菌作用机制的研究[J].农业工程学报，2002，18（1）：122 ～125.

[6]刘德海.纤维素酶酶活的测定方法[J].中国饲料，2002，17：27～30.

[7]Sanchaisurinya P，Thammabut B.Effect of pineapple waste in growing-finishing pig diets[J].Kaen-Kaset Agriculture Journal，1994，22（4）：193 ～197.