高效液相色谱法测定饲料中替米考星含量

2010-04-28北京市兽药监察所闫小峰孙志文

中国饲料 2010年9期

北京市兽药监察所闫小峰孙志文

替米考星是一种以泰乐菌素为前体半合成的畜禽专用大环内酯类抗生素，且由顺式和反式两种异构体以85∶15的比例混合而成的白色粉末，在甲醇、乙腈、丙酮中易溶，在乙醇、丙二醇中溶解，在水中不溶，主要用于治疗猪胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌及支原体引起的感染（中国兽药典委员会，2006）。李秀红等（2006）指出，动物性产品中替米考星残留会对人类造成致敏性、毒性反应，长期食用还会改变人类肠道菌群失调，产生细菌耐药性。近年来，已建立了水产品、羊乳、猪组织等多种动物性产品中替米考星残留检测方法（苏秀华等，2009；王雪敏等，2009；李存等，2005；农业部958号公告-1-2007；农业部1025号公告-10-2008），但饲料中替米考星检测仅为国家标准规定的方法（农业部783号公告-4-2006）。本实验旨在建立一套简便、灵敏、准确的饲料中替米考星的检测方法，以更好地满足我国饲料质量检测的要求。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂离心机（CF16RX HITACHI）、涡旋混合器（MS3 IKA）、振荡器（KS 260 IKA）旋转蒸发仪（B-490 BUCHI）、超纯水机（Milli-Q Millipore）、高效液相色谱仪（Waters 2695 996二极管阵列检测器）。替米考星标准品（纯度91.0%，批号：K0310711，中国兽医药品监察所），C18固相萃取柱：500 mg/6 mL，乙腈、四氢呋喃为色谱醇，其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 主要溶液配制

1.2.1 10%磷酸溶液：取100 mL磷酸缓慢加入900 mL水中，边加边搅拌，用水稀释至1000 mL。

1.2.2 二丁胺磷酸缓冲液（1 mol/L）：取10%磷酸溶液700 mL，缓慢加入168 mL二丁胺，边加边搅拌。冷却至室温，用85%磷酸调pH至2.5，加水稀释至1000 mL。

1.2.3 流动相（乙腈-四氢呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸盐缓冲液，130∶55∶25，V/V/V）：分别量取130 mL乙腈、55 mL四氢呋喃、25 mL二丁胺磷酸盐缓冲液，依次加入700 mL水中，用水稀释至1000 mL，0.45 μm 滤膜过滤。

1.2.4 洗脱液（0.1 mol/L乙酸胺甲醇-乙腈，20∶80，V/V）：称取7.71 g乙酸胺溶解于200 mL甲醇中，加790 mL混匀，冷却至室温，用乙腈稀释至1000 mL。

1.2.5 磷酸二氢钾缓冲液：称取13.61 g磷酸二氢钾溶解于800 mL水中，用磷酸调pH值至2.5，再用水稀释至1000 mL。

1.2.6 替米考星标准溶液（5 mg/mL）：精密称取替米考星标准品约55 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释到刻度。

1.3 色谱条件色谱柱：C18柱 5 μm，250 mm×4.6 mm i.d.（Symmetry Waters）；检测波长：290 nm；流动相：乙腈-四氢呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸盐缓冲液（130∶55∶25，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL。

1.4 样品处理

1.4.1 提取：称取2 g饲料样品（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入 8 mL乙腈，涡旋1 min，中速振荡 20 min，10000 r/min 离心 10 min，取上清液于50 mL离心管中，残渣中依次加入5 mL磷酸二氢钾缓冲液和8 mL乙腈，涡旋1 min，中速振荡20 min，10000 r/min离心10 min，合并两次上清液，10000 r/min离心5 min，取上清液于100 mL烧杯中，加水40 mL混匀，为样品提取液。

1.4.2 净化：将C18固相萃取柱，依次用10 mL甲醇和10 mL水平衡，将样品提取液过柱，自然流干，再依次用10 mL水和10 mL乙腈洗涤，抽真空干燥5 min，用5 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液，30℃水浴中氮气吹干。加2.0 mL流动相溶解，经微孔滤膜过滤，供高效液相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 线性关系用流动相将替米考星标准溶液分别配制成浓度为1、5、10、50、100 μg/mL 和500 μg/mL的系列标准，在选择的色谱条件下，进样20 μL，观察峰面积（顺式和反式异构体的峰面积之和，y）与浓度（x，μg/mL）之间的关系，结果见图1。由图1可得回归方程y=20984x-936.25，相关系数r=1。

1.2 临床资料收集收集所有患者入急诊科后的基础临床数据，包括病史、年龄、性别、心电图、高血压病、糖尿病、高脂血症等，所有病例入院当天急诊抽血查肌钙蛋白Ⅰ，分别运用 HEART评分和MEWS评分进行病情评估。

2.2 检测限在本实验的色谱条件下，信噪比S/N=3时，替米考星的最低检测浓度为1 μg/g。

2.2 方法的准确度——回收率实验准确称取2 g阴性饲料，分别添加不同浓度的替米考星标准溶液，制成样品浓度为 10、100 μg/g 和 400 μg/g的样品，每个浓度做5个平行，在本实验分析条件下进行测定，结果见表1，色谱图见图2～图4。结果可知，平均回收率为81.4%～92.6%，变异系数分别为6.1%、4.8%、1.9%。

图1 替米考星标准溶液的工作曲线

表1 回收率及变异系数（n=5）

图2 替米考星标准溶液色谱图（10 μg/mL）

图3 空白饲料样品色谱图

图4 添加样品色谱图（10 μg/mL）

2.3 方法的精密度实验准确称取2 g阴性饲料5份，添加替米考星标准溶液，制成样品浓度为100 μg/g的样本，在本实验分析条件下进行测定，结果见表2。由表2可知，变异系数为4.8%。

2.4 波长选择替米考星标准溶液在本实验分析条件下，用二极管光阵列检测器采集波长210～400 nm的紫外吸收光谱图，结果见图5。

由图5可知，最大吸收波长为289.1 nm，因此选择290 nm处测定。

2.5 流动相的确定本实验采用乙腈-四氢呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸盐缓冲液经一定的配比制成的流动相，通过调整配比，发现当乙腈-四氢呋喃-1 mol/L 二丁胺磷酸盐缓冲液（130∶55∶25，V/V/V），流速为1.0 mL/min时，替米考星的保留时间比较合适，并避免了杂质峰的干扰。

表2 精密度实验结果

图5 替米考星标准品光谱图（10 μg/mL）

2.6 柱温的确定分别对柱温20、25℃和30℃进行了实验。实验结果表明，3种温度替米考星分离效果均良好，30℃时保留时间最短，20℃时保留时间最长。综合分析，对柱温不做要求。

2.7 提取液的选择本实验比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和乙腈-磷酸盐缓冲液作为提取液，试验结果表明，先用乙腈提取，再用磷酸盐缓冲液和乙腈的混合溶液提取，杂质少，回收率高。样品提取液在固相萃取柱前加水稀释，是为了增加溶液的极性，使药物更好的被SPE柱吸附。

2.8 萃取柱的选择比较了不同填料的SPE柱，如 C18、HLB、MAX、MCX，最终选择了 C18（500 mg/6 mL）固相萃取柱，该萃取柱回收率高，净化效果好。样品通过SPE柱时，流速控制在15～20滴/min。流速过快，回收率低，流速过慢，结果重复性差。

2.9 离心速度的确定饲料本身比较松散，离心时如果速度过低，就不能有效地将提取液与饲料样本有效地分开，导致提取液不能有效地转移，影响回收率，如果转移时转移了一些饲料固体，那么会给样品净化带来困难。再由于饲料本身含有大量的蛋白质，通过高速离心的方式也可起到沉淀蛋白质的作用，因此，本实验条件下将离心转速定为10000 r/min。